Delist.ru

Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда (17.08.2007)

Автор: Никитенко Леонид Леонидович

Оценка экспрессии CD38 на клетках костного мозга проводилась с помощью прямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием Р-фикоэритрин-меченых моноклональных антител к CD38 (Caltag Laboratories, США) по стандартной методике. Под иммерсией (( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. CD38+ клетки костного мозга, дающие желто-оранжевое свечение по периметру клетки, определяли по наличию иммунопозитивного материала.

Оценка экспрессии P2X7 на клетках костного мозга проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к рецептору P2X7 (Sigma, США) по стандартной методике. Под иммерсией (( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. P2X7+ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с P2X7, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Оценка экспрессии коннексина 43 (Cx43) на клетках костного мозга проводилась с помощью двойного непрямого метода иммунофлуоресцентного анализа с использованием моноклональных антител к Cx43 (Chemicon International, США). Под иммерсией (( 900) подсчитывали относительное количество клеток, несущих флуоресцентную метку на 200 клеток. Cx43+ клетки костного мозга, дающие зеленое свечение по периметру клетки, определяли по наличию участков связывания антител с Cx43, экспрессируемым на плазматической мембране клеток.

Статистическую обработку результатов проводили методами математической статистики с применением пакетов прикладных программ «Биостатистика для Windows, версия 4.03» и «Microsoft Excel 2002». Для каждого исследуемого признака определяли показатели среднего арифметического (М) и стандартной ошибки среднего арифметического (m). Нормальность распределения проверяли с использованием теста Колмогорова-Смирнова. При условии соответствия нормальности распределения достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Сопряженность между признаками устанавливали путем проведения корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции (r) Пирсона. Различия считались достоверными при уровне значимости, равном либо менее 5% (Р(0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ксенобиотики антрациклинового ряда занимают одно из ведущих мест в арсенале современных лекарственных средств, используемых при лечении злокачественных новообразований различных локализаций и прежде всего при химиотерапии опухолей кроветворного аппарата. Одним из типичных представителей группы антрациклиновых антибиотиков, относящимся к числу наиболее эффективных и перспективных цитостатических средств, является доксорубицин (адриамицин). Накопленные к настоящему времени сведения о клеточных «мишенях» действия доксорубицина позволяют предположить высокую значимость механизмов окислительного стресса в повреждении клеток этим ксенобиотиком, а моделирование окислительного стресса представляет собой экспериментальный подход к изучению клеточных механизмов его токсического действия.

В экспериментах in vitro нами установлено, что при внесении доксорубицина в концентрациях 5(10-7 М, 10-6 М, 5(10-6 М в костномозговую суспензию in vitro происходило дозо-зависимое увеличение продукции МДА, свидетельствующее об интенсификации процессов ПОЛ мембран клеток костного мозга, что позволяет отнести данный ксенобиотик к группе индукторов окислительного стресса. Введение ксенобиотика in vivo также приводило к нарастанию концентрации МДА в клетках костного мозга к 24 часу до 12,92 ( 0,56 мкмоль/л (Р<0,001), с последующим снижением до 8,24 ( 1,11 мкмоль/л после 2 суток введения и 4,97 ( 0,94 мкмоль/л (Р<0,02) после 10 суток введения доксорубицина.

Одним из обязательных компонентов патогенеза окислительного стресса является изменение количественных и качественных параметров пула внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов в результате их окисления и гидролиза и нарушение АТФ-синтетических процессов в клетке. Действительно, в экспериментах, выполненных нами с использованием биолюминесцентного и спектрофотометрического методов определения внутри- и внеклеточного содержания АТФ и НАД+, установлено, что острое и подострое введение доксорубицина мышам in vivo и инкубация клеток костного мозга с доксорубицином в концентрации 10-6 М in vitro приводили к изменению внутри- и внеклеточного содержания АТФ и НАД+ в клетках костного мозга.

Так, через 24 ч и 48 ч после острого введения ксенобиотика концентрация АТФ внутри клеток достоверно уменьшилась. Однако к 10 суткам подострого воздействия доксорубицина уровень внутриклеточной и внеклеточной АТФ в костном мозге достоверно увеличился (Рис. 2).

Рис. 2. Концентрация АТФ (А) и НАД+ (Б) в клетках костного мозга и во внеклеточном пространстве при остром и подостром введении доксорубицина (ДОК) in vivo и инкубации клеток с доксорубицином

(10-6 М) in vitro

Примечание. Здесь и далее: Р ( уровень значимости; достоверность отличий по сравнению с контролем: * Р(0,05; ** Р(0,02; *** Р(0,01; **** Р(0,001.

Воздействие ксенобиотика на клетки костного мозга in vitro и in vivo сопровождалось также нарушением количественных параметров пула НАД+: через 24 ч и 48 ч после острого введения доксорубицина уровень НАД+ внутри клеток достоверно не изменился, тогда как во внеклеточной жидкости его концентрация повысилась по сравнению с исходным значением. Аналогичная ситуация наблюдалась при предварительной инкубации клеток костного мозга с доксорубицином в дозе 10-6 М in vitro. К 10 суткам подострого воздействия доксорубицина in vivo уровень внутриклеточного и внеклеточного НАД+ в костном мозге достоверно увеличился (Рис. 2).

Мы считаем, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД+ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда значимо модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул за счет изменения их экспрессии, что вызывает нарушение процессов передачи информации в клетке или запрограммированной клеточной гибели.

Нами впервые обнаружено, что доксорубицин изменяет экспрессию P2X7 в клетках костного мозга. Воздействие ксенобиотика in vivo в течение 1 суток значительно снижало количество P2X7+ клеток костного мозга. Однако к 10 суткам введения их количество практически вернулось к контрольным значениям (Рис. 3). Это соответствовало уменьшению уровня внутриклеточной АТФ при остром курсе введения доксорубицина и его увеличению при подостром курсе введения ксенобиотика, соответственно.

Рис. 3. Особенности экспрессии P2X7, CD38 и Cx43 в клетках костного мозга в норме и при остром и подостром введении

доксорубицина (ДОК) in vivo

Выявленная нами альтерация уровня пиридиновых нуклеотидов (НАД+), вызванная действием индуктора окислительного стресса, может быть связана с активацией НАД+-гликогидролаз, принимающих участие в передаче сигналов и некоторых метаболических проводящих путях. В связи с этим интересным представлялось изучение особенностей экспрессии CD38 (как одного из типичных представителей класса НАД+-гликогидролаз, использующих НАД+) в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

Нами впервые установлено, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД+-гликогидролазы/CD38. Продемонстрировано, что острое и подострое воздействие ксенобиотика приводило к снижению экспрессии CD38 в клетках костного мозга мышей, сопровождающемуся уменьшением его суммарной ферментативной активности (Рис. 3). Понижение количества CD38+ клеток соответствовало увеличению уровня внутри- и внеклеточного НАД+. Кроме того, вероятна и обратная связь: избыток субстрата (НАД) приводил к уменьшению экспрессии CD38. Следовательно, нарушение экспрессии CD38 характеризуется значимыми изменениями метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках (Рис. 4).

Рис. 4. Схема нарушения метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках под действием доксорубицина

Обозначения. Здесь и далее: серым цветом указаны собственные оригинальные результаты.

Коль скоро доказано, что АТФ и НАД+, действуя через пуринергические рецепторы, локализованные на плазматической мембране и обладающие функциональной активностью для обоих эндогенных регуляторов, и НАД+-гликогидролазу/CD38, высвобождаются во внеклеточную среду посредством щелевых контактов, сформированных коннексинами и выполняющих аутокринную и паракринную регуляцию клеточной активности, следующим этапом наших исследований явилась оценка степени экспрессии коннексина 43 (Cx43), как основного коннексина кроветворной ткани, в клетках костного мозга мышей при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина in vivo.

Нами установлено, что острое введение ксенобиотика in vivo увеличивало экспрессию Cx43 в костном мозге. К 10 дню подострого введения доксорубицина in vivo степень экспрессии возвращалась к контрольным значениям (Рис. 3).

Таким образом, доксорубицин нарушает лиганд-рецепторные взаимодействия, призванные осуществлять сигнально-временную координацию важнейших тканевых процессов, что, в свою очередь, является причиной формирования внутрипопуляционных изменений количественного или качественного плана. Последствия изменения лиганд-рецепторных взаимодействий подразумевают как краткосрочные, так и долговременные перестройки клеточного метаболизма и нарушения регуляции пролиферативного или дифференцировочного статуса клетки, как, впрочем, и клеточной смерти.

Известно, что основными механизмами поражения костного мозга, возникающего при действии цитостатиков, являются миелосупрессия в результате глубокого подавления пролиферативной деятельности костного мозга, связанного, в свою очередь, с гибелью значительной части пролиферирующих клеток и блокированием митотического цикла гемопоэтических элементов, а также свободнорадикальные механизмы, приводящие к индукции окислительного стресса, повреждению липидов и белков мембран и цитоскелета.

Действительно, нами установлено, что угнетающему эффекту доксорубицина подверглись как эритроидный (индукция пролиферации мегалобластов), так и миелоидный (увеличение количества миелоцитов) ростки гемопоэза при отсутствии изменений со стороны тромбоцитарного ростка. Выявленное нами отчетливое повышение числа мегалобластов как при остром, так и подостром введении ксенобиотика отражает развитие анемии, о чем свидетельствует также уменьшение индекса созревания эритробластов, являющегося критерием нарушения созревания нормобластов. Причем процент мегалобластов при однократном воздействии доксорубицина в МПД был выше, чем после 10-ти дневного курса введения ксенобиотика, что соответствует литературным данным о том, что ингибирующий эффект антибиотиков-антрациклинов на кроветворение более отчетливо проявляется при их однократном введении в массивных (LD50, МПД) дозах, чем при курсовом введении в терапевтических дозах.

Миелоингибирующий эффект доксорубицина проявлялся в виде повышенной гибели костномозговых элементов. В экспериментах, выполненных нами с использованием техники культивирования клеток костного мозга мышей в диффузионных камерах в перитонеальной полости мышей-реципиентов, установлено, что доксорубицин в концентрациях 5(10-7, 10-6, 5(10-6 М в дозо-зависимой манере эффективно подавлял колоние- и кластерообразующую способность клеток костного мозга при совместной инкубации с ним в предимплантационный период (Табл. 1). При этом ксенобиотик в равной степени ингибировал образование как колоний, так и кластеров, что подтверждает неспецифический характер цитотоксичности последнего в отношении клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

Таблица 1. Влияние прединкубации клеток костного мозга с доксорубицином (ДОК) на колоние- (КОС) и кластерообразующую (КлОС) способность и процессы запрограммированной клеточной смерти при культивировании в диффузионных камерах

Серия КОС КлОС Апоптоз, %

Контроль 16,08 ( 2,67 121,38 ( 13,46 2,19 ( 0,33

ДОК, 5(10-7 М 15,0 ( 3,83 107,25 ( 10,88 5,83 ( 0,95****

ДОК, 10-6 М 7,44 ( 1,15*** 68,69 ( 5,15**** 4,14 ( 0,30****

ДОК, 5(10-6 М 6,33 ( 1,38**** 56,25 ( 5,91**** 3,25 ( 0,43****

Обозначения. Здесь и далее КОС и КлОС представлены как абсолютное количество колоний и кластеров, соответственно, на 105 имплантированных клеток.

Примечание. n (объем выборки) в разных сериях от 5 до 16.

Таким образом, обнаруженное нами гемопоэзповреждающее действие доксорубицина, сопровождающееся внутрипопуляционными изменениями в костном мозге, происходит на фоне нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации, что, в конечном итоге, отражается на развитии неэффективного гемопоэза как болезни дизрегуляции в механизме регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки (Рис. 5).

Механизмы поражения клеток костного мозга в условиях применения цитостатиков связаны, помимо нарушения пролиферативного статуса, с индукцией окислительного стресса. Признавая ключевую роль нарушения работы дыхательной цепи митохондрий в цитотоксическом действии доксорубицина, мы оценили выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга при внесении в среду инкубации АТФ или НАД+ на фоне введения доксорубицина in vitro и in vivo.

АТФ при внесении в инкубационную среду не влияла на продукцию МДА интактными клетками, проявляя при этом дозо-зависивый эффект. Однако она тормозила этот процесс в клетках костного мозга, подвергнутых действию доксорубицина в течение 24 часов in vivo, и потенцировала его в клетках, выделенных от животных после 10-дневного введения ксенобиотика (Рис. 6). Выраженность окислительного стресса в клетках костного мозга соответствовала направленности изменений концентрации внутриклеточной АТФ: снижение концентрации АТФ после острого введения доксорубицина и ее повышение в результате подострого введения ксенобиотика согласуется со

Рис. 5. Схема нарушения экспрессии молекул межклеточной коммуникации в развитии неэффективного гемопоэза

способностью АТФ подавлять и стимулировать продукцию реактивного кислорода, соответственно, при действии на гемопоэтические клетки.

загрузка...