Delist.ru

Роль нарушений межклеточных взаимодействий в патогенезе миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда (17.08.2007)

Автор: Никитенко Леонид Леонидович

Научная новизна.

Установлено, что одним из значимых клеточных механизмов токсического действия ксенобиотика антрациклинового ряда в клетках костномозгового происхождения является индукция дизрегуляторных процессов в механизмах межклеточной коммуникации и интеграции.

Впервые установлена роль нарушения P2X7-ассоциированных сигнальных механизмов в реализации действия миелотоксических ксенобиотиков и изучены некоторые механизмы пуринергической дизрегуляции.

Доказано, что клеточные механизмы миелотоксического действия доксорубицина ассоциированы с нарушением экспрессии и функциональной активности НАД+-гликогидролазы/CD38. Изучена роль НАД+-гликогидролазы/CD38 в регуляции метаболизма НАД+ в гемопоэтических клетках в условиях окислительного стресса.

Впервые обнаружено, что нарушение экспрессии и функциональной активности коннексина 43 является одним из механизмов цитотоксического эффекта доксорубицина.

Исследованы механизмы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток в костном мозге аденозинтрифосфатом и никотинамидадениндинуклеотидом. Изучены закономерности изменения степени чувствительности клеток костного мозга к присутствующим во внеклеточном пространстве естественным метаболитам при действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

Приоритетное значение имеют данные о том, что нарушение гомеостаза АТФ и НАД+ при действии ксенобиотика антрациклинового ряда (доксорубицина) модифицирует процессы межклеточных взаимодействий и регуляторную активность сигнальных молекул.

Выявлено, что поддержание гомеостаза НАД+ в клетках костного мозга является условием нормальной межклеточной коммуникации и внутриклеточной сигнализации. Экспериментально доказано, что применение субстратных ингибиторов НАД-конвертирующих ферментов позволяет эффективно блокировать вызванное ксенобиотиком истощение клеточного пула НАД+ и связанное с этим изменение пролиферативной активности клеток и программы клеточной смерти в гемопоэтических клетках.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Данная работа является фрагментом тем «Биохимия и патобиохимия апоптоза», «Исследование гомеостаза при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях» (номер государственной регистрации 01970007696) и «Структурно-функциональные основы гомеостаза животных при экстремальных состояниях», выполняющихся на базе кафедры биохимии с курсом медицинской химии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» с 2002 г., Международного научного центра исследований экстремального состояния организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с 1995 г. и на кафедре анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» с 1998 г., соответственно.

Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы новые клеточные механизмы миелотоксического действия ксенобиотика антрациклинового ряда с позиции нарушения регуляторной функции АТФ и НАД+ и межклеточной коммуникации в гемопоэтических клетках, следствием чего является изменение чувствительности клеток к действию эндогенных лигандов.

Патогенетически обоснован способ коррекции миелотоксического действия доксорубицина никотинамидом – субстратным ингибитором ферментов каталитической деградации НАД+, обеспечивающий нормализацию клеточного пула НАД+ и связанное с этим восстановление процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток, что может являться основой для разработки новой терапевтической стратегии в лечении нарушений гемопоэза.

Постулируется нарушение в условиях окислительного стресса регуляторного влияния естественных метаболитов на клеточные функции, что подразумевает возможность его коррекции путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации, представляющей собой мощный современный инструмент для создания новых высокоэффективных лекарственных препаратов, строго избирательно воздействующих на определенные биологические мишени и обладающих как агонистическим или антагонистическим, так и модуляторным действием.

Основной научно-технической задачей, решенной в ходе выполнения работы, явилось формирование современных представлений о роли дизрегуляции межклеточных взаимодействий и возможности ее коррекции при цитотоксическом действии ксенобиотика антрациклинового ряда.

В рамках работы оформлена заявка на патент «Способ диагностики системного воспалительного ответа организма при критических состояниях» (2007 г.) (Регистрационный № 2007109001).

Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ООО «Лаборатория иммунохимических методов исследования» (г. Красноярск), НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН и учебный процесс кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», кафедры биохимии ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фундаментальной и клинической биохимии с курсом лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», кафедры фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармацевтической технологии и последипломного образования ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза», Красноярск, 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме (с международным участием) «Гомеостаз и окружающая среда», Красноярск, 1997 г.; 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997 г.; научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Технологии неистощительного землепользования», Красноярск, 1997 г.; IX Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Канадзава (Япония), 2001 г.; городской научно-практической конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории СГМУ «Современные аспекты биологии и медицины», Томск, 2002 г.; XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма», Красноярск, 2003 г.; межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2003 г.; X Российско-Японском международном медицинском симпозиуме «Якутия – 2003», Якутск, 2003 г.; XI Международном Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Ниигата (Япония), 2004 г.; XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004 г.; X Юбилейной межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2004 г.; Всероссийской конференции молодых ученых, Красноярск, 2004 г.; XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии», Санкт-Петербург, 2005 г.; V Сибирском физиологическом съезде, Томск, 2005 г.; XII Симпозиуме Российско-Японского медицинского обмена, Красноярск, 2005 г; научных семинарах Межкафедральной биохимической научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (2004-2007 гг.); заседаниях кафедры анатомии и физиологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (1998-2007 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

Одним из значимых механизмов миелотоксического действия ксенобиотиков антрациклинового ряда является индукция дизрегуляторных процессов в системе межклеточной коммуникации и интеграции, проявляющаяся изменением экспрессии молекул межклеточной коммуникации (пуринергических рецепторов P2X7, НАД+-гликогидролазы/CD38 и коннексина 43) и сопровождающаяся нарушением мембран-цитоскелетных взаимодействий, пролиферативного и дифференцировочного статуса клеток костного мозга и их чувствительности к действию апоптогенных стимулов и эндогенных регуляторов гемопоэза.

Ксенобиотики антрациклинового ряда регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения за счет нарушения внутриклеточного гомеостаза НАД+ и пуринергической регуляции гемопоэза.

АТФ и НАД+, присутствуя во внеклеточном пространстве при действии миелотоксического ксенобиотика доксорубицина, модулируют процессы паракринной и аутокринной регуляции функциональной активности клеток костного мозга.

Патогенетическая коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков антрациклинового ряда эффективно достигается применением субстратных ингибиторов ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 12 – в центральной печати (в реферируемых ВАК журналах), 2 – в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, иллюстрирована 13 таблицами и 39 рисунками. Библиографический указатель включает 462 литературных источника, в том числе 86 отечественных и 376 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 510 белых беспородных мышах-самцах (Рис. 1). Культивирование клеток костного мозга in vitro в концентрации 1(106 клеток в 1 мл проводилось в термостате при +37(С в питательной среде ((-МЕМ («Gibco», Великобритания), среде 199 с L-глутамином («Вектор», Россия), растворе Хенкса («Вектор», Россия), сбалансированном фосфатном буфере (Sigma, США) в течение 1 ч с последующей регистрацией эффектов ксенобиотика, а также модуляторов острой и подострой экзогенной интоксикации in vitro и in vivo методами диффузионных камер, спектрофотометрическими, биолюминесцентными, микроскопическими и иммуноцитохимическими методами.

Изучение токсического влияния доксорубицина гидрохлорида (далее по тексту – доксорубицин, ДОК) («Ферейн», Россия) на клетки костного мозга in vitro производилось при совместной инкубации суспензии клеток костного мозга с ксенобиотиком (5(10-7 - 10-6 - 5(10-6 М) в течение 60 минут при +37(С, а также в условиях его предварительной инкубации (15 минут) в присутствии экзогенного корректора никотинамида в концентрации 1 мМ и последующем культивировании (5 суток) в диффузионных камерах в перитонеальной полости животных-реципиентов и эндогенных регуляторов АТФ и НАД.

Исследование влияния доксорубицина на клетки костного мозга in vivo проводилось при остром однократном введении мышам в максимально переносимой дозе (МПД – 6 мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром внутрибрюшинном введении в дозе 1/10 LD50 (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Исследование влияния АТФ и НАД на костномозговые клетки in vitro проводилось при совместной инкубации суспензии клеток с АТФ (Reanal, Венгрия) и НАД (Reanal, Венгрия) в концентрациях 0,1, 1, 10 мМ и 1 мМ, соответственно, в течение 1 ч при +37(С, а также на фоне применения доксорубицина in vitro в дозе 10-6 М, который добавляли в среду культивирования костномозговых клеток на 15 минуте инкубации, или in vivo при остром однократном введении мышам в МПД (6 мг/кг) внутрибрюшинно в физиологическом растворе, а также подостром введении в дозе 1/10 LD50 (0,95 мг/кг) в течение 10 дней с интервалом 24 ч.

Прединкубация клеток с никотинамидом (Мосхимфармпрепараты, Россия) в концентрации 1 мМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду НАД и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Прединкубация клеток с блокаторами пуринергических рецепторов PPADS (пиридоксальфосфат-6-азофенил-2(,4(-дисульфоновая кислота) (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ и сурамином (Sigma, США) в концентрации 100 мкМ проводилась в течение 15 минут с последующим добавлением в среду АТФ или доксорубицина и совместным инкубированием клеток в течение 1 ч.

Для исследования пролиферативного статуса клеток костного мозга методом диффузионных камер in vivo клетки получали путем вымывания питательной средой (80% среды (-МЕМ («Gibco», Великобритания), 20% лошадиной сыворотки, 100 мг/л ампициллина) из 2 бедренных костей мыши-донора. Клетки в концентрации 1(106/мл добавляли в питательную среду и заполняли ею диффузионные камеры (по 0,1 мл на камеру). Диаметр пор фильтра камер 0,22 мкм. Камеры имплантировали в перитонеальную полость мышей-реципиентов (по 2 камеры на животное) хирургическим путем под гексеналовым наркозом. Через 5 дней культивирования мышей выводили из эксперимента методом дислокации спинного мозга в шейном отделе, камеры извлекали, фильтры окрашивали гематоксилин-эозином. Методом световой микроскопии подсчитывали число образовавшихся колоний (скопления из 50 и более клеток) и кластеров (скопления менее 50 клеток) (( 400).

Определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в суспензии клеток костного мозга проводили путем измерения содержания малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по стандартной методике, включающей в себя инкубацию с ТБК исследуемой пробы, экстракцию продуктов реакции бутанолом и спектрофотометрическое измерение их содержания.

Определение концентрации АТФ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили с помощью биолюминометра 8802 (СКТБ «Наука», Россия) по методу Угаровой Н.Н. (1981).

Определение концентрации НАД+ в клетках костного мозга и внеклеточном пространстве проводили спектрофотометрически с использованием алкогольдегидрогеназы по методу Асатиани В.С. (1969).

Оценка цитотоксичности доксорубицина в МТТ-тесте проводилась с использованием тетразольной соли МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) (Sigma, США) в дозе 5 мг/мл, которую добавляли по 50 мкл в каждую пробу. Клетки костного мозга инкубировали с МТТ в течение 1,5 ч при +37(С. В конце инкубационного периода кристаллы формазана растворяли путем добавления 500 мкл 0,1 н НСl-изопропанола. Оптическую плотность исследуемых проб определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 570 нм, фоновую плотность – при длине волны 640 нм, и по разности двух измерений находили искомую величину.

Изучение процессов апоптоза клеток, культивируемых в диффузионных камерах, проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией (( 900) анализировалось по 200 клеток на каждом фильтре, окрашенном гематоксилин-эозином. При этом морфологическими признаками апоптоза считали наличие «карликовых» клеток, кариопикноз, кариорексис, наличие апоптотических телец.

Исследование миелограммы по мазкам костного мозга проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией (( 900) анализировалось по 500 клеток на каждом препарате, окрашенном по Папенгейму. При выведении миелограммы выделяли следующие клеточные формы: недифференцированные бласты, промиелоциты, миелоциты, юные нейтрофилы, палочкоядерные нейтрофилы, сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты, плазматические клетки, эритробласты, пронормобласты, нормобласты базофильные, нормобласты полихроматофильные, нормобласты оксифильные, мегалобласты, мегакариоциты. По полученным данным рассчитывали лейкоэритробластическое соотношение и индекс созревания эритробластов.

Детекция апоптоза и некроза в препаратах клеток костного мозга проводилась по оценке экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны путем регистрации связывания ФИТЦ-меченого аннексина V и проницаемости мембран для пропидия йодида (Annexin V Apoptosis Detection Kit, Caltag Laboratories, США), соответственно, согласно протоколу фирмы-производителя и последующей флуоресцентной микроскопии. Под иммерсией (( 900) анализировали по 200 клеток на каждом стекле. Определяли относительное количество клеток 4 популяций: жизнеспособные (неокрашенные ни аннексином V, ни пропидия йодидом), находящиеся на ранней стадии апоптоза (положительные по аннексину V при отсутствии окрашивания ядра пропидия йодидом и дающие зеленое свечение), находящиеся в состоянии вторичного некроза (положительные и по аннексину V и по пропидия йодиду и дающие зелено-красное свечение) и собственно некротические клетки (положительные только по пропидия йодиду и дающие красное свечение).

Регистрация блеббинга плазматической мембраны клеток костного мозга осуществлялась методом фазово-контрастной микроскопии при инкубации клеток в течение 60 мин при +37(С. Под иммерсией (( 900) анализировалось по 200 клеток в каждом препарате, приготовленном через 5, 15, 30, 45 и 60 минут инкубации клеток костного мозга (1х106/мл) в среде 199. По морфологии цитоплазматической мембраны дифференцировали следующие виды клеток костного мозга: интактные клетки (морфологически неизмененные клетки, имеющие четкую, контрастирующуюся светло-желтым ободком плазматическую мембрану); клетки в состоянии начального блеббинга (образование небольших пузырей на поверхности мембраны); клетки в состоянии терминального блеббинга (образование крупных, ? и более от диаметра клетки пузырей); некротические клетки (в 1,5-2 раза крупнее интактных клеток, отсутствует свечение в виде светло-желтого ободка по периметру клетки, имеют неровную мембрану).

загрузка...