Delist.ru

Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции (17.08.2007)

Автор: Николаева Марина Аркадьевна

Процент индуцированной АР определяли в пробе, содержащей ионофор А23187. Индуцируемость АР вычисляли как разность между процентом индуцированной и спонтанной АР. Анализируя в каждой пробе по 5000 клеток, определяли процент сперматозоидов с завершенной АР, представленных субпопуляцией клеток со сниженной зеленой и красной флуоресценцией (рис. 6Б).

С помощью предложенного способа было проведено сравнение акросомного статуса активно-подвижных сперматозоидов, полученных из эякулятов бесплодных пациентов, у которых были выявлены тепловые АСАТ (MAR%=100%, n=13) или холодовые АСАТ (ПЦМ%>25%, n=5) на поверхности клеток. В качестве контрольной группы были использованы сперматозоиды фертильных доноров, на поверхности которых ни тепловые, ни холодовые антитела не выявлялись (n=10). Процент спонтанной АР в образцах сперматозоидов, покрытых как тепловыми, так и холодовыми АСАТ, был существенно выше по сравнению с образцами сперматозоидов фертильных доноров (рис.7).

Рис. 7. Уровень спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции и индуцируемости АР в образцах, содержащих (1) АСАТ-негативные сперматозоиды фертильных доноров, (2) сперматозоиды, покрытые холодовыми антителами и (3) сперматозоиды, покрытые тепловыми антителами

Достоверных различий между образцами, содержащими сперматозоиды, покрытые тепловыми и холодовыми АСАТ, выявлено не было. Процент АР, индуцированной ионофором, был значительно ниже в MAR-позитивных образцах (р<0,05) по сравнению с образцами фертильных пациентов. Также выявлено существенное снижение индуцируемости АР в обеих группах бесплодных пациентов по сравнению с фертильными донорами. Был обнаружен парадоксальный ингибирующий эффект ионофора А23187 на спонтанную АР у 54% (7/13) бесплодных пациентов с тепловыми и у 80% (4/5) пациентов с холодовыми антителами.

Проведенное исследование продемонстрировало, что АСАТ к поверхностным антигенам сперматозоидов могут стимулировать АР. Известно, что процессы агрегации поверхностных антигенов сперматозоидов играют ключевую роль в физиологическом протекании АР (Tesarik J. and Mendoza C., 1993; Lassale B. and Testart G., 1996). Возможно, спонтанная АР сперматозоидов, покрытых антителами, также может быть связана с агрегацией иммунных комплексов, происходящей при связывании антител с поверхностными антигенами. Как было показано ранее, агрегация иммунных комплексов является одним из свойств, характерных для MAR-позитивных клеток. Известно, что ионофор А23187 является ингибитором агрегации (Young-Karlan B.R. and Ashman R.F., 1981), и нельзя исключить, что его добавление к сперматозоидам, покрытым антителами, также вызывает ингибирование агрегации иммунных комплексов и блокирует спонтанную АР.

Одним из механизмов индукции АР в присутствии АСАТ может быть усиление продукции свободных радикалов кислорода (СРК). Регулируемый процесс свободнорадикального окисления является важнейшей составляющей метаболизма сперматозоидов, необходимой для капацитации и акросомной реакции, деконденсации хроматина и процессов фертилизации (Aitken R.J. et al., 1998; De Lamirande E. et al., 1998).

?????????u?T

?????????¤?¤????????u

0 что максимальный уровень генерации СРК в образцах, содержащих холодовые АСАТ (MAR%=0%, ПЦМ%>25%, n=5), значительно выше, чем в MAR-позитивных образцах (MAR%=100%, n=10) - интенсивность люминесценции составляла 7,6 и 1,2 Мв/106 клеток, соответственно (р<0,03). Генерации СРК в образцах, полученных от фертильных доноров (n=20), не наблюдалось.

Мы предположили, что ингибирование генерации СРК может привести к уменьшению воздействия антител на клеточный метаболизм. В качестве ингибитора перекисного окисления нами был использован N-ацетилцистеин, внутриклеточное деацетилирование которого приводит к образованию тиолового антиоксиданта глутатиона (Mayer M. and Noble M., 1994). Однако ингибирование спонтанной АР в присутствии N-ацетилцистеина наблюдалось лишь в 4 из 10 (40%) МАR-позитивных образцов, содержащих тепловые АСАТ, и в 6 из 12 (50%) MAR-негативных образцов, содержащих холодовые антитела. В остальных случаях присутствие антиоксиданта стимулировало спонтанную АР.

Интенсивность генерации СРК может определять результат воздействия СРК на клетку - приводить либо к активации клетки и АР, либо к повреждению клеточных мембран. Нельзя исключить, что стимуляция АР происходит лишь в узком «коридоре» между активирующим и повреждающим уровнем СРК, так как избыток СРК блокирует индукцию АР (Ichikawa T. et al., 1999). Поэтому снижение генерации СРК может приводить не только к блокированию АР, но и к ее индукции, что согласуется с нашими данными.

., et al., 1997), поэтому нельзя было исключить, что отмывка сперматозоидов от семенной жидкости стимулирует генерацию СРК сперматозоидами, покрытыми антителами, активацию сперматозоидов и акросомную реакцию in vitro.

Таблица 1

Анализ подвижности сперматозоидов фертильных доноров и покрытых тепловыми или холодовыми АСАТ сперматозоидов бесплодных пациентов (M±SD)

Параметр Фертильные

(MAR%=0%) Бесплодные

(MAR%=100%) Бесплодные

(MAR%=0%, ПЦМ > 25%) Уровень значимости различий ( Р )

( n = 5) ( n = 11) ( n = 5)

VSL (мкм/сек) 26,4 ± 6,6a 28,3 ± 8,7 30,2 ± 3,6a a < 0,04

VCL (мкм/сек) 50,6 ± 11,1 б 61,4 ± 21,1 68,6 ± 11,6 б б < 0,03

VAP (мкм/сек) 34,0 ± 6,7в 43,0 ± 13,6 42,6 ± 5,4в в < 0,05

LIN (%) 55,6 ± 6,3 г, д 45,9 ± 8,9 г 42,6 ± 9,3 д г < 0,05; д < 0,03

STR (%) 78,3 ± 7,1 69,9 ± 12,3 72,7 ± 6,4

ALH (мкм) 3,5 ± 0,7 е, ж 4,7 ± 1,3 е 4,8 ± 0,5 ж е = 0,07; ж < 0,01

Присутствие АСАТ на поверхности сперматозоидов рассматривается в ряде работ как причина снижения подвижности клеток (Mathur S. et al., 1984), однако различий между группами по содержанию активно-подвижных сперматозоидов нами выявлено не было.

В то же время было продемонстрировано увеличение прогрессивной (VSL), трековой (VCL) и путевой (VAP) скорости сперматозоидов, покрытых холодовыми антителами. При этом наблюдалось снижение линейности движения (LIN) и увеличение амплитуды бокового смещения головки (ALH). Особенностью МAR-позитивных сперматозоидов также являлось снижение линейности движения и тенденция к увеличению амплитуды бокового смещения головки. Изменение этих параметров движения клеток, покрытых антителами, свидетельствуют о гиперактивации сперматозоидов. Движения гиперактивированных сперматозоидов не являются прямолинейными: характерно более глубокое сгибание хвоста, поэтому траектория движения такого сперматозоида напоминает цифру “8” или звездочку. Гиперактивация характеризуется снижением LIN и увеличением ALH (Robertson L. et al., 1988; Mortimer S.T. and Mortimer D., 1990) и рассматривается как одно из проявлений капацитации - серии функциональных, биохимических и биофизических изменений сперматозоида, необходимых для АР и оплодотворения (Yanagimachi R., 1969).

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов нарушения репродуктивной функции при наличии антиспермальных антител является функциональная и метаболическая активация сперматозоидов, приводящая к стимуляции преждевременной АР и снижению вероятности оплодотворения. Кроме того, активация сперматозоидов может сопровождаться изменениями антигенного состава поверхности сперматозоида - шеддингом одних антигенов и демаскировкой или экспрессией других (Benoff S. et al., 1993), а также разрушением плазматической мембраны в ходе АР, что делает невозможным использование живых сперматозоидов для количественного выявления АСАТ с помощью ПЦМ.

Мы предположили, что наиболее перспективным способом количественной оценки уровня антител, независимым от клеточных реакций, может быть выявление АСАТ с помощью латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов. Метод ПЦМ был адаптирован для выявления АСАТ на поверхности латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов (BioServ Diagnostics, Германия), которые инкубировали c сывороткой крови или семенной жидкостью, а затем с ФИТЦ-мечеными козьими антителами к IgG, IgА или IgМ человека. С помощью предложенного подхода были получены неожиданные результаты: высокая активность связывания антител класса G с латексными частицами наблюдалась в MAR-негативных сыворотках не только бесплодных, но и фертильных мужчин и женщин.

Согласно общепринятой точке зрения, АСАТ, присутствующие в сыворотке и секретах фертильных пациентов, являются низкоаффинными и не оказывают влияния на процессы оплодотворения. Считается, что выработка АСАТ к внутриклеточным антигенам сперматозоидов является физиологическим механизмом, обеспечивающим элиминацию поврежденных или мертвых сперматозоидов. В последнее время большое внимание уделяется также изучению естественных антител – низкоаффинных, полиреактивных антител, распознающих ограниченное количество аутоантигенов и выявляющихся в норме в кровотоке доноров (Bayry J. et al., 2004).

Мы предположили, что выявленные нами антитела могут специфично реагировать с белками теплового шока (БТШ) - консервативными иммунодоминантными антигенами, экспрессируемыми большинством клеток конститутивно или в ответ на различные стрессорные воздействия (Lindquist S. and Craig E.A., 1988). Для выявления специфичности АСАТ, присутствующих в сыворотках фертильных мужчин и женщин, оценивали ингибирование связывания АСАТ с латексными частицами, покрытыми антигенами сперматозоидов, в присутствии мАТ к БТШ с молекулярным весом 25 кДа (БТШ25), 60 кДа (БТШ60), 70 кДа (БТШ70) и 90 кДа (БТШ90) (Sigma, США). Максимальное ингибирование связывания АСАТ (84%) наблюдалось в присутствии МАТ к БТШ90. Таким образом, большая часть антител, выявляемых на поверхности латексных частиц, представлена антителами к БТШ90.

Известно, что БТШ90 является конститутивным белком, выявляемым в большинстве типов клеток (Picard D., 2002) и экспрессируемом сперматозоидами (Neuer A. et al., 2000). Ранее было установлено, что естественные антитела, выявляющиеся в норме в кровотоке доноров, могут взаимодействовать с БТШ90 (Pashov A., et al., 2002). Эти данные, а также выявление антител к БТШ90 у девушек (рис. 10) позволяют предположить, что обнаруженные нами антитела могут являться естественными аутореактивными антителами, и/или продуцироваться при антигенной стимуляции белками теплового шока, экспрессируемыми сперматозоидами и/или аутологичными клетками репродуктивного тракта мужчин и женщин. Было обнаружено, что антитела к БТШ90 являются маркером, отражающим состояние антиспермального иммунитета у мужчин и женщин. Обнаружена негативная корреляция между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 в сыворотке женщин с бесплодием неясного генеза (рис. 8). Активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов, выявляемая в сыворотке крови женщин с иммунным фактором бесплодия (MAR%>40%), была существенно ниже, чем у фертильных женщин (рис.10).

При тестировании сывороток мужчин с бесплодием неясного генеза также была выявлена отрицательная зависимость между результатами выявления АСАТ и антител к БТШ90 (r= - 0,67, р<0,02, n=13). Активность антител к БТШ90 в семенной жидкости MAR-позитивных образцов была также значительно ниже (4,0 УЕФ), чем в MAR- негативных образцах (8,5 УЕФ; р<0,001) и образцах фертильных доноров (17,7 УЕФ; р<0,01).

Оценка антигенсвязывающей активности антител к БТШ90 в сыворотках может быть использована для диагностики иммунного бесплодия у женщин (чувствительность 100%, специфичность - 100% при ПЦМ% < 30,8%). У мужчин иммунный фактор бесплодия может быть диагностирован с чувствительностью 100% и специфичностью 93,3% при активности антител к БТШ90 в семенной жидкости, превышающей 5,8 УЕФ. Предлагаемый способ имеет целый ряд преимуществ: выявление антител к БТШ90, в отличие от MAR-теста, является объективным и не требует трудоемкого микроскопического анализа; при выявлении антител к БТШ90 не требуется наличия активно-подвижных сперматозоидов, а используется стандартный набор реагентов с длительным сроком хранения, что позволяет оптимизировать и стандартизировать тестирование, а также существенно упростить организацию проведения анализа, исключив необходимость процедуры получения спермы у половых партнеров обследуемых женщин в день проведения анализа.

Таким образом, формирование антител к БТШ90 с высокой антигенсвязывающей активностью наблюдается в отсутствии АСАТ, а наличие иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин диагностируется при слабой иммунной реакции на БТШ90. Полученные результаты согласуются с результатами исследования, проведенного Domagala A. and Kurpisz M. (2004), подтвердивших, что частота выявления антител к некоторым антигенам сперматозоидов, лимфоцитов и эритроцитов у здоровых фертильных мужчин была существенно выше по сравнению с бесплодными пациентами с иммунной формой бесплодия.

Было проведено дополнительное исследование, подтвердившее, что высокая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90, выявляемая в сыворотке крови, является маркером толерантности к аллоантигенам полового партнера у женщин. Анализировали зависимость пролиферативной реакции лимфоцитов женщины (группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности) на лимфоциты полового партнера от уровня активности антител к БТШ90.

При использовании однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов было показано, что при высокой активности антител к БТШ90 пролиферативная реакция лимфоцитов жены на лимфоциты мужа отсутствовала (рис.9). При снижении активности антител к БТШ90 наблюдалось увеличение пролиферативной реакции. Уровень активности антител к БТШ90 не влиял на пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины на лимфоциты донора.

Таким образом, высокая активность антител к БТШ90 является маркером толерантности иммунной системы женщин к аллоантигенам полового партнера, при которой отсутствуют как гуморальные, так и клеточные иммунные реакции на аллоантигены.

Была исследована активность антител к БТШ90 в сыворотке крови в процессе изменения репродуктивного статуса здоровых женщин и женщин с нарушениями репродуктивной функции (рис.10). Было выявлено возрастание активности антител к БТШ90, связанное с началом половой жизни – активность антител у женщин, ведущих половую жизнь без контрацепции не менее полугода и не имевших беременности, была выше по сравнению с этим показателем у девушек (рис. 10).

Рис.10. Активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сеперматозоидов, выявляемая в сыворотках крови девушек (n=7), здоровых женщин, не имевших беременности (n=6), фертильных беременных женщин (n=18), фертильных женщин вне беременности (n=9) женщин с иммунным фактором бесплодия (n=7) и пациенток с угрозой прерывания беременности (n=8)

загрузка...