Delist.ru

Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции (17.08.2007)

Автор: Николаева Марина Аркадьевна

Контрольную группу составили 30 супружеских пар, имеющих детей, обратившихся для подбора метода контрацепции. Женщины, включенные в контрольную группу, в течение последних 12 месяцев с момента обращения имели беременность. Клинико-лабораторное обследование девушек проводилось совместно с отделением детской гинекологии НЦ АГиП (руководитель профессор, д.м.н. Уварова Е.В.). Клинико-лабораторное обследование пациенток с привычным невынашиванием беременности (n=25) проводилось совместно с лабораторией клинической иммунологии ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (зав. лабораторией – заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю.).

Материалом для непосредственного исследования служили гепаринизированная кровь и сыворотка крови из кубитальной вены, цервикальная слизь, эякулят.

Классификация спермограмм выполнялась согласно стандартному протоколу ВОЗ (Руководство ВОЗ, 1999).

Выявление АСАТ на поверхности сперматозоидов или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов, проводили на проточных цитофлуориметрах FACScan и FACSCalibur (Becton Dickinson, США), Bryte (Bio-Rad, США), анализируя в каждой пробе по 5000 клеток или латексных частиц, покрытых антигенами сперматозоидов.

Для выявления локализации АСАТ на поверхности сперматозоидов. применялся метод флуоресцентной микроскопии. Образцы анализировались с помощью микроскопа фирмы Leitz Laborlux S ( Leica, Germany) при увеличении * 400.

Для оценки влияния АСАТ, присутствующих в сыворотке крови, на подвижность сперматозоидов в присутствии комплемента использовали тест спермоиммобилизации (Isojima S. et al., 1968). Индекс спермо-иммобилизации (ИСИ) вычисляли, как отношение процента подвижных сперматозоидов в образце, не содержащем комплемент, к этому показателю в образце с комплементом.

Компьютерный анализ спермы (Computer Assisted Semen Analysis, CASA) проводился совместно с отделением вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Кузьмичев Л.Н.). С помощью анализатора Hamilton Thorn (США) оценивали подвижность сперматозоидов (процент быстро-, средне-, медленно-подвижных и неподвижных сперматозоидов) и скорости движения сперматозоидов по различным траекториям: VCL (curvilinear velocity) – трековая скорость (мкм/сек); VAP (average path velocity) – путевая скорость (мкм/сек); VSL (straight-line velocity) – прямолинейная скорость (мкм/сек).

Измерение уровня генерации свободных радикалов кислорода (СРК) в эякуляте проводили методом хемилюминесценции, используя люминометр LKB-Wallac 1256 (Финляндия). К суспензии клеток добавляли люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион). Оценивали максимальное значение люминисценции, которое наблюдалось через 2-10 минут после добавления люминола. Уровень генерации СРК выражали в мВ/сек.

Лимфоциты периферической крови получали с использованием среды для выделения лимфоцитов Lymphosep (ICN, USA). Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток определяли с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson, США), меченных флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином. Процедуру окрашивания клеток и последующий анализ методом ПЦМ проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика.

Для получения однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов половых партнеров лимфоциты мужчин предварительно обрабатывали митомицином С (Sigma, США). Клетки культивировали в течение 5 суток и оценивали интенсивность пролиферации колориметрическим методом с использованием бромистого метилтиазолилтетразолия (Кравченко И.Н. с соавт., 1992). Оптическую плотность измеряли при 550 нм на планшетном фотометре (Bio-Rad, США). Пролиферативную реакцию лимфоцитов женщины оценивали как отношение оптической плотности в смешанной культуре к показателям оптической плотности монокультур лимфоцитов половых партнеров.

Campbe????????††††††††††††††††††

Результаты работы и их обсуждение

Методом, рекомендованным ВОЗ для выявления антиспермальных антител (АСАТ), является МАR (mixed agglutination reaction) - тест (Руководство ВОЗ, 1999). В основе теста лежит связывание Fc-фрагментов иммуноглобулинов (Ig) класса G (IgG), сорбированных на поверхности латексных частиц, и Fc-фрагментов IgG на мембране сперматозоидов антисывороткой к Fc-фрагменту IgG человека. Мы предположили, что тот же принцип может быть использован для выявления АСАТ методом проточной цитометрии (ПЦМ), который, в отличие от MAR-теста, позволит не только выявлять различные классы иммуноглобулинов, связанные с поверхностными антигенами сперматозоидов, но и оценивать количество антител на поверхности сперматозоидов.

Для выявления АСАТ на поверхности сперматозоидов с помощью ПЦМ клетки инкубировали с мышиными антителами к IgG, IgA и IgM человека (Sigma, США), а затем с ФИТЦ-мечеными антителами к Fc-фрагменту мышиных иммуноглобулинов. С помощью «окна дискриминации» на двухпараметрической цитограмме распределения клеток по прямому и угловому светорассеянию из анализа исключали разрушенные клетки и агглютинаты. Мертвые клетки исключали из анализа, используя окрашивание иодидом пропидия - флуоресцентным красителем, проникающим только в клетки с поврежденной мембраной (Evenson D.P. et al., 1982), и анализировали только живые клетки (рис. 1Б, субпопуляции а,б). Активность связывания АСАТ с поверхностными антигенами характеризовали, оценивая процент живых сперматозоидов, покрытых АСАТ (рис. 1Б, субпопуляция б), и количество АСАТ, связанных с поверхностью сперматозоидов.

Рис.1. Результаты выявления АСАТ, представленных IgG, на поверхности (А) MAR-негативных (MAR%=0%) и (Б) MAR-позитивных (MAR%=100%) сперматозоидов методом проточной цитофлуорометрии. (а) - субпопуляция живых АСАТ-негативных сперматозоидов; (б) - субпопуляция живых АСАТ-позитивных сперматозоидов; (в) - субпопуляция мертвых сперматозоидов

Для характеристики количества АСАТ использовали среднюю интенсивность зеленой флуоресценции АСАТ-позитивных сперматозоидов, выраженную в условных единицах флуоресценции (УЕФ).

При сравнении результатов выявления АСАТ, представленных IgG (АСАТ IgG), на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью MAR-теста и ПЦМ-теста была выявлена положительная корреляция (рис.2А). Чувствительность и специфичность ПЦМ теста при выявлении MAR-позитивных образцов (MAR% ? 50%) составляла 89% и 86%, соответственно, при очень низком пороговом значении ПЦМ% (>3%).

Рис. 2. Зависимость между результатами выявления АСАТ на поверхности живых сперматозоидов бесплодных пациентов с помощью MAR-теста и ПЦМ-теста. (А) MAR% варьировал от 0% до 100%; (Б) MAR%=100%

При анализе MAR-позитивных образцов спермы, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ (MAR%=100%, n=53), с помощью ПЦМ выявлялось лишь 37±28% сперматозоидов, покрытых АСАТ IgG(рис.2Б).

Хотя при выявлении АСАТ IgG в сыворотке крови мужчин (n=20) чувствительность и специфичность ПЦМ-теста по сравнению с МAR-тестом составили 100% при пороговом значении ПЦМ%>15%, процент АСАТ-позитивных сперматозоидов, выявляемых с помощью ПЦМ в образцах, где все сперматозоиды были покрыты АСАТ IgG (MAR%=100%), варьировал от 45% до 93%. При выявлении АСАТ IgG в сыворотке крови женщин (n=24) также была выявлена сниженная чувствительность (64%) и высокая специфичность(100%) ПЦМ-теста при пороговом значении ПЦМ% >49%.

Была проведена оценка диагностической значимости выявления АСАТ, представленных различными классами иммуноглобулинов, в секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин.

Для оценки чувствительности и специфичности ПЦМ-теста для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин сравнивали результаты выявления АСАТ в эякуляте пациентов с иммунным фактором бесплодия (MAR%>50%, n =81) и у фертильных пациентов (MAR%?8, n=13) (рис.3).

Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия с помощью ПЦМ составила при выявлении АСАТ IgG (ПЦМ%> 13%) 64% и 92%, при выявлении АСАТ IgА (ПЦМ%>3%) 96% и 100%, и при выявлении АСАТ IgM (ПЦМ%>8) 42% и 92%, соответственно. Наблюдалась слабая зависимость между присутствием АСАТ IgG и IgM (r=0,44, р = 0,0001), АСАТ IgА и IgG (r=0,38, р = 0,0001) и АСАТ IgA и IgM (r=0.29, р = 0,007). У пациентов с иммунным фактором бесплодия чаще всего на поверхности сперматозоидов выявлялись АСАТ IgA (96%) , причем в в 33% присутствовали АСАТ IgG, IgA и IgM , в 30% случаев выявлялись АСАТ IgG и IgA, в 7% - АСАТ IgA и IgM, а в 26% образцов выявлялись только АСАТ IgA. Антитела класса G выявлялись лишь у 1% пациентов. Была выявлена положительная корреляция между результатами выявления АСАТ IgG в эякуляте и сыворотке с помощью ПЦМ-теста (r=0,62, р=0,007, n=20) и MAR-теста (r=0,89, р=0,001, n=20).

При использовании полученных критериев был выявлен иммунный фактор бесплодия у 17% (13/76) мужчин с бесплодием неясного генеза, причем в 11 случаях (15%) выявлялись АСАТ IgG и IgA, у 1 пациента (1%) выявлялись только AСАТ IgG, и у одного пациента (1%) были выявлены АСАТ IgM.

Особое диагностическое значение могло иметь использование ПЦМ-теста для выявления АСАТ в цервикальной слизи, так как в этом случае MAR-тест не может быть использован из-за высокой вязкости цервикальной слизи, а с помощью метода спермоиммобилизации не могут быть выявлены АСАТ класса A, так как IgA не фиксируют комплемент.

На рисунке 4 представлены результаты выявления АСАТ в цервикальной слизи пациенток с бесплодием неясного генеза (n=36)и фертильных женщин (n=10). Чувствительность и специфичность выявления иммунного фактора бесплодия у женщин с бесплодием неясного генеза составила при выявлении АСАТ IgG (диагностически значимый уровень ПЦМ%>14%) 22% и 100%, при выявлении АСАТ IgА (ПЦМ%>11%) 33% и 90%, и при выявлении АСАТ IgM (ПЦМ%>3%) 13% и 80%, соответственно. Таким образом, выявление АСАТ в цервикальной слизи обладает большой диагностической значимостью - у 14 из 36 (39%) пациенток с бесплодием неясного генеза уровень хотя бы одного из трех классов АСАТ превышал диагностически значимый и, таким образом, диагностировался иммунный фактор бесплодия.

Чаще всего в цервикальной слизи пациенток с иммунным фактором бесплодия выявлялись АСАТ IgA (86%), причем в 14 % присутствовали IgG, IgA и IgM АСАТ, в 43 % случаев выявлялись IgG и IgA АСАТ, а в 29% образцов выявлялись только IgA АСАТ. Были обнаружены также образцы, в которых выявлялись только АСАТ IgM (14%).

Не было выявлено зависимости между содержанием АСАТ IgG и АСАТ IgA как в цервикальной слизи, так и в сыворотке женщин.

Очевидные преимущества ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом – объективность, возможность анализа большого числа образцов при использовании даже слабо подвижных или неподвижных сперматозоидов, выявление АСАТ классов A, G и M – позволяют использовать предложенный способ для диагностики иммунного фактора бесплодия.

В то же время была обнаружена низкая чувствительность выявления АСАТ IgG с помощью ПЦМ-теста по сравнению с MAR-тестом. Поэтому следующим этапом исследования явился анализ возможных причин получения ложно-негативных результатов ПЦМ-теста.

Было установлено, что в процессе выявления АСАТ при использовании поливалентных антител может происходить агрегация и сбрасывание – шеддинг (англ. shedding- сбрасывание) комплексов антиген-антитело в окружающую среду, и, таким образом, количество связавшихся с поверхностью АСАТ и количество АСАТ, оставшихся на поверхности сперматозоидов, выявляемое методом ПЦМ, могут различаться в десятки раз (Nikolaeva M.A. et al., 2000). Интенсивность шеддинга зависела от множества факторов: особенностей метаболизма сперматозоидов, условий проведения анализа, концентрации АСАТ и вторых антител. При определенных условиях наблюдалось полное удаление комплексов антиген-антитело с поверхности клеток.

Шеддинг иммунных комплексов наблюдался и при использовании моноклональных антител 4Е3 и 1Е10 к поверхностному антигену сперматозоидов - тестикулярной изоформе ангиотензин-превращающего фермента (тАПФ) (Nikolaeva M.A. et al., 2006).

Высокая вероятность агрегации и шеддинга поверхностных комплексов антиген-антитело ограничивает возможность использования ПЦМ для количественного выявления АСАТ. Очевидно, что большое значение приобретает поиск способов ингибирования этих процессов. Стандартные способы блокирования агрегации, обычно применяемые для других типов клеток, такие, как низкая температура, использование азида натрия и цитохалазина В, не приводили к ингибированию агрегации и шеддинга комплексов антиген-антитело с поверхности сперматозоидов в MAR-позитивных образцах. Более того, выявление АСАТ при низкой температуре (4°С) более чем в 5 раз снижало количество АСАТ на поверхности клеток (р<0,0005) по сравнению с количеством АСАТ, выявляемым при 23°С. Однако неожиданно при 4°С были выявлены АСАТ на поверхности живых сперматозоидов в MAR-негативных образцах спермы пациентов c бесплодием неясного генеза (рис.5). Бесплодие, обусловленное присутствием АСАТ, выявляемых при 4°С, диагностировалось среди пациентов с бесплодием неясного генеза с чувствительностью 20% и специфичностью 100% при ПЦМ%>15%. Таким образом, было впервые продемонстрировано существование АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся лишь в определенном температурном диапазоне.

В целом, частота выявления иммунного фактора бесплодия в группе пациентов с бесплодием неясного генеза составила 37% - у 17% пациентов на поверхности сперматозоидов выявлялись тепловые АСАТ, а в 20% случаев - холодовые АСАТ.

Было установлено, что выявление тепловых АСАТ на поверхности клеток возможно лишь в том случае, если оба Fab-фрагмента IgG связываются с антигенами. Маркером «сшивки» антигенов бивалентными антителами является агрегация поверхностных иммунных комплексов - двухмерный аналог процесса преципитации. Как MAR-тест, так и ПЦМ-тест могут эффективно выявлять тепловые АСАТ лишь при условии эквивалентности концентраций антигенов и антител. Холодовые АСАТ выявлялись при 4°С и проявляли так называемую функциональную моновалентность, когда лишь один Fab-фрагмент был связан с поверхностным антигеном. При этом агрегация поверхностных комплексов отсутствовала – на поверхности головки сперматозоидов MAR-негативных образцов спермы, содержащих холодовые АСАТ, с помощью флуоресцентной микроскопии выявлялось гомогенное распределение флуоресценции.

Следующим этапом исследования явилось выяснение механизмов клеточных реакций на образование поверхностных иммунных комплексов и поиск способов их блокирования. Очевидно, что изучение механизмов влияния АСАТ на функциональную активность сперматозоидов необходимо как для оптимизации выявления АСАТ, так и для понимания патогенетической роли АСАТ при бесплодии и выбора адекватных методов коррекции бесплодия, обусловленного иммунными факторами.

Оценивали влияние АСАТ на функции сперматозоидов – скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию. Не было выявлено зависимости между присутствием тепловых и холодовых АСАТ на поверхности сперматозоидов нативной спермы и процентом активно-подвижных сперматозоидов в эякуляте. Спермоиммобилизирующая активность сывороток крови женщин с бесплодием неясного генеза, содержащих тепловые АСАТ (MAR%=100%, n=9) была существенно ниже, чем активность сывороток, содержащих холодовые АСАТ (MAR%=0%, ПЦМ%>25%, n=6) - индекс спермоиммобилизации (ИСИ) составил 1,4±0,5 и 8,1±6,1, соответственно (р<0,005). Спермоиммобилизирующей активности АСАТ-негативных сывороток пациенток с бесплодием неясного генеза (n=20) и сывороток фертильных женщин (n=10) выявлено не было (ИСИ?1,0).

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида в яйцеклетку, является акросомная реакция (АР) - рецепторно-опосредованный экзоцитоз ферментов, разрушающих прозрачную оболочку яйцеклетки (zona pellucida) (Yanagimachi R., 1988). В норме АР происходит при связывании сперматозоида с оболочкой яйцеклетки. Существуют два основных типа нарушений, препятствующих оплодотворению и приводящих к бесплодию, – спонтанная АР, которая происходит еще до взаимодействия сперматозоида и яйцеклетки, и отсутствие индукции АР при связывании сперматозоида с zona pellucida. Показана возможность диагностики бесплодия с помощью определения процента сперматозоидов с завершенной АР после индукции АР ионофором А23187 (Tesarik J., 1996). Так как метод флуоресцентной микроскопии, используемый для определения акросомного статуса, трудоемок и субъективен, нами был предложен новый способ оценки АР с помощью ПЦМ.

Для оценки АР сперматозоидов было использовано одновременное окрашивание сперматозоидов двумя лектинами: ФИТЦ-меченым P. Sativum, который связывается с маннозными остатками акрозина, являющегося основным компонентом акросомального матрикса, и ТРИТЦ-меченым A.hypogaea, взаимодействующим с (-D-галактозильными остатками, локализованными на наружной акросомальной мембране (Aitken R.J. and Brindle J.P., 1993). Процент спонтанной АР определяли в контрольной пробе, не содержащий ионофор.

Рис. 6. Оценка акросомного статуса сперматозоидов фертильного пациента с помощью ПЦМ. Определение процента (А) спонтанной АР и (Б) АР, индуцированной ионофором А23187, на двухпараметрической цитограмме распределения клеток по интенсивности зеленой и красной флуоресценции.

загрузка...