Delist.ru

Антитела к антигенам сперматозоидов человека в норме и при нарушениях репродуктивной функции (17.08.2007)

Автор: Николаева Марина Аркадьевна

Важнейшей функцией сперматозоидов, играющей ключевую роль в проникновении сперматозоида через оболочку яйцеклетки, является акросомная реакция (АР) - рецептор-опосредованная активация и высвобождение протеолитических ферментов (Yanagimachi R., 1988). Данные о влиянии АСАТ на АР противоречивы: в одних исследованиях показано ингибирование АР при наличии АСАТ (Benoff S. et al.,1993), в работах других авторов выявлена стимуляция преждевременной, спонтанной АР (Lansford B. et al., 1990, Harrison S. et al., 1998, Bohring C. et al., 2001).

Противоречивые представления о функциях АСАТ-позитивных сперматозоидов могут быть также обусловлены субъективным характером методов, используемых для оценки этих функций. Так для оценки акросомного статуса используется трудоемкий и субъективный метод флуоресцентной микроскопии.

Очевидно, что для формирования современных представлений о влиянии антиспермального иммунитета на репродуктивную функцию человека необходима разработка новых адекватных методов выявления АСАТ в различных биологических жидкостях бесплодных и фертильных пациентов, а также создание объективных методов оценки влияния АСАТ на оплодотворяющую способность сперматозоидов.

Цель работы

Характеристика иммунных реакций на антигены сперматозоидов в норме и при нарушениях репродуктивной функции у мужчин и женщин с помощью новых объективных количественных способов выявления антиспермальных антител и оценки функций сперматозоидов.

Задачи исследования

1. Разработка объективного количественного способа выявления антител к антигенам сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

2. Количественная оценка уровня антител к антигенам сперматозоидов в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта у фертильных и бесплодных мужчин и женщин.

3. Разработка объективного способа оценки акросомной реакции сперматозоидов с помощью метода проточной цитофлуорометрии.

4. Оценка влияния антиспермальных антител на функции сперматозоидов – скорость движения, генерацию активных форм кислорода, акросомную реакцию.

5. Выявление зависимости уровня антиспермальных антител от состояния клеточного звена иммунитета у мужчин и женщин.

Научная новизна исследования

Впервые предложен объективный количественный способ выявления антиспермальных антител классов G, A и М на поверхности живых сперматозоидов, присутствующих в эякуляте, а также после инкубации сперматозоидов в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта мужчин и женщин.

Продемонстрировано существование в сыворотках крови и секретах репродуктивного тракта бесплодных мужчин и женщин АСАТ теплового и холодового типа, выявляющихся на поверхности живых сперматозоидов лишь в определенном температурном диапазоне.

Установлено, что количество АСАТ на поверхности клеток зависит от интенсивности клеточных реакций, сопровождающих связывание АСАТ с поверхностными антигенами сперматозоидов, что является причиной низкой чувствительности выявления антител в биологических жидкостях с помощью метода проточной цитофлуорометрии (ПЦМ).

Впервые установлено, что присутствующие в сыворотках крови как фертильных, так и бесплодных мужчин и женщин антитела к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90), взаимодействуют с антигенами сперматозоидов.

Впервые в сыворотках крови фертильных мужчин и женщин и в семенной жидкости выявлена высокая активность связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов. Установлено, что низкая антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 в сыворотке крови и семенной жидкости мужчин и в сыворотке крови небеременных женщин является маркером нарушений репродуктивной функции.

Обнаружено, что увеличение антигенсвязывающей активности антител к БТШ90, присутствующих в периферической крови женщин, связано с началом половой жизни.

Впервые выявлена зависимость между активностью связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов и состоянием клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, представленного регуляторными ?? Т- лимфоцитами.

Впервые разработан объективный количественный способ оценки акросомного статуса сперматозоидов с помощью окрашивания гамет лектинами Pisum sativum (P.sativum), меченным флуоресцеин- изотиоцианатом, и Аrachis hypogaea (A.hypogaea), меченным тетраметилродамин-изотиоцианатом, и последующего анализа методом ПЦМ.

Впервые показано, что преждевременная активация сперматозоидов, происходящая при связывании АСАТ с поверхностью клеток, является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции.

Практическая значимость работы

Разработаны диагностические критерии для выявления иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, основанные на количественном выявлении антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта с помощью ПЦМ.

Установлено, что оценка активности связывания антител к БТШ90 с антигенами сперматозоидов является прогностическим показателем при выявлении иммунного фактора бесплодия у мужчин и женщин, а также при диагностике угрозы прерывания беременности.

Разработаны диагностические критерии для выявления бесплодия, обусловленного нарушениями функций сперматозоидов, основанные на количественной оценке спонтанной и индуцированной ионофором А23187 акросомной реакции с помощью ПЦМ.

Реализация результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в программу лекций кафедры лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава» и в практическую работу лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 4 Всесоюзном симпозиуме «Иммунология репродукции» (Киев, 1990), VII Всемирном конгрессе по иммунологии репродукции человека (Хельсинки, Финляндия, 1990), 7 Всемирном конгрессе по цервикальной патологии и кольпоскопии (Италия, Рим, 1990), Республиканской научной конференции по иммунологии репродукции (Иваново, 1993), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (1993, Киев), конференции «Иммунологический мониторинг и иммунореабилитация» (Москва, 1995), 11 международном конгрессе по андрологии (Анкара, Турция, 1995), Международном симпозиуме по акросомной реакции сперматозоидов (Коллюр, Франция, 1995), 3 международном форуме по репродуктивной иммунологии (Берлин, Германия, 1996), Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Киев, 1996), Международном симпозиуме по мужскому бесплодию и репродуктивным технологиям (Генк, Бельгия, 1998), 8 Международном симпозиуме по сперматологии (Монреаль, Канада, 1998), европейском симпозиуме по иммунологии репродукции (Рим, Италия, 1999), 1 международной конференции «Хроноструктура и хроноэкология» (Москва, 2000), II Российском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2000), Второй международной конференции по экспериментальной и клинической репродуктивной иммунобиологии (Амстердам, Нидерланды, 2000), XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (С.-Петербург, 2003), Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 2003), Европейском конгрессе репродуктивной иммунологии (Плзень, Чехия, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2004), Международной научной конференции "Ломоносов-2005" (Москва, 2005), IX Всероссийском научном Форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005), II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии (Москва, 2005), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007), 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Сочи, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту

Присутствие антиспермальных антител в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта у мужчин и у женщин вне беременности, выявляемых с помощью метода проточной цитофлуорометрии, является маркером нарушения репродуктивной функции. Антиспермальные антитела гетерогенны по изотипу, температурному оптимуму связывания с антигенами и механизмам влияния на функции сперматозоидов.

Преждевременная активация сперматозоидов при образовании поверхностных комплексов антиспермальных антител с антигенами является одним из механизмов нарушения репродуктивной функции. При активации сперматозоидов меняется траектория движения сперматозоидов, усиливается генерация свободных радикалов кислорода, увеличивается вероятность преждевременной акросомной реакции и снижается вероятность оплодотворения.

Маркером толерантности иммунной системы фертильных мужчин и женщин к антигенам сперматозоидов является высокая активность связывания антител к белкам теплового шока с молекулярным весом 90 кДа (БТШ90) с антигенами сперматозоидов, выявляемая в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта. Антигенсвязывающая активность антител к БТШ90 отражает состояние антиспермального иммунитета и регуляторного клеточного звена иммунной системы мужчин и женщин, являясь прогностическим показателем при выявлении нарушений репродуктивной функции.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 298 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, 4 глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 425 источников. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (руководитель лаборатории академик РАМН, д.м.н., профессор Сухих Г.Т.). Комплексное клинико-лабораторное обследование пациентов, состоящих в бесплодном браке, проводилось совместно с отделением восстановления и сохранения репродуктивной функции НЦ АГиП (рукводитель д.м.н., профессор Назаренко Т.А.).

В группу с иммунным фактором бесплодия включали мужчин (n=395) или женщин (n=182), в сыворотке крови и секретах репродуктивного тракта которых были обнаружены антиспермальные антитела. Выявление антиспермальных антител проводили с помощью MAR-теста (Ferti Pro N.V., Бельгия) стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Позитивными значениями MAR-теста считали значения MAR%?50% (Руководство ВОЗ, 1999).

В группу с бесплодием неясного генеза были включены мужчины (n=123) с нормозооспермией и отсутствием в анамнезе сексуально-передаваемых инфекций, хирургических вмешательств, травм половых органов, орхитов и варикоцеле. Бесплодие неясного генеза у женщин (n=123) было подтверждено с помощью клинико-лабораторного исследования, включавшего тесты функциональной диагностики, проведение лапароскопии, гистероскопии, исследования уровня гормонов, посткоитального теста, ультразвукового исследования.

загрузка...