Delist.ru

Изменения рецепторной специфичности вирусов гриппа при смене хозяев (10.09.2007)

Автор: Гамбарян Александра Сергеевна

Чтобы понять, с чем связано расхождение результатов данного исследования, проведенного в основном на вирусах, изолированных на культуре клеток МДСК, от результатов полученных ранее на свиных вирусах, выделенных на куриных эмбрионах, мы проанализировали последовательности H1 HА депонированные в Лос-Аламосовской базе данных. Все Н1 вирусы, выделенные от свиней и индюшек имеют замену Glu190/Asp(Asn) по сравнению с консенсусом вирусов уток. У вирусов выделенных позднее 2000 года, как правило, заменена также 225 аминокислота: Gly225/Asp. Отметим, что именно эти две замены ответственны за рецепторный фенотип человеческих H1N1 вирусов. Причем, при адаптации человеческих ВГ к куриным эмбрионам очень часто возникает реверсия Asp225/Gly, возвращающая вирусу способность связывать «птичий» сиалил2-3галактозный рецептор (Gambaryan et al., 1999; Matrosovich et al., 2000).

Мы предполагаем, что наличие Asp225 в свиных ВГ после 2000 года связано не с реальным изменением вирусов, а с изменением способа выделения. После того, как были открыты «вторичные» линии свиных вирусов, происходящие из человеческих ВГ, стал практиковаться метод выделения свиных вирусов на клеточной культуре, так как современные человеческие вирусы плохо выделяются в куриных эмбрионах.

При выделении на культуре, содержащей сиалил2-6галактозные рецепторы, вирусу нет необходимости настраиваться на «птичий» рецептор и он сохраняет свой исходный генотип и фенотип. Таким образом, мы наблюдаем глубокий параллелизм в формировании рецепторной специфичности человеческих и свиных H1N1 вирусов.

Распознавание Sia2-3Gal рецепторов с разным сахаридным кором.

Первичная замена Glu190/Asp дает вирусу возможность связывать 6`SLN –рецепторы, однако сохраняет возможность связывать и 3`SL-рецепторы. Такой двойной рецепторной специфичностью обладали некоторые изоляты вируса «испанки» и “avian-like” вирусы свиней, недавно перешедшие от птиц к свиньям.

Мы исследовали рецепторную специфичность ряда ВГ H1N1, изолированных от свиней и индеек с сочетанием Asp190 и Gly225 с помощью полимеров, несущих группировки 6`SLN, SLec, Su-SLec, 3`SLN, Su-3`SLN, SLex и Su-SLex. Все вирусы связывали 6`SLN, однако все они с максимальным сродством связывали Su-SLex.

Поводя итог, можно сказать, что адаптация птичьего вируса к свиньям проходит через две фазы. Вирусы, попавшие в свиней недавно (“avian-like”) обладают смешанным рецепторным фенотипом, распознавая как 2-3, так и 2-6 связь между сиаловой кислотой и галактозой, и с тенденцией к увеличению сродства к сульфатированным рецепторам. Однако специализированные к свиньям вирусы, так же как и человеческие, перестают распознавать Sia2-3Gal рецепторы, и настроены на 6`SLN.

Для “avian-like” вирусов оптимальными являются сульфатированные формы Sia2-3Gal рецепторов, в первую очередь Su-SLex. Как было показано выше, именно к этой форме рецептора адаптируются ВГ домашней птицы. Вирусы, «классической» линии начинают с высоким сродством распознавать этот же рецептор в результате одной реверсии Asp/Gly225, при этом вирус сохраняет способность инфицировать свиней.

Многие исследователи (Lipkind et al., 1984, Altmuller et al., 1992; Wright et al. 1992; Suarez et al., 2002; Choi et al., 2004) описывали межвидовую трансмиссию ВГ между свиньями и индейками. Можно высказать гипотезу, что способность распознавать «куриный» рецептор облегчает такую трансмиссию. Регулярная трансмиссия между свиньями и птицами (в особенности, если в ней участвуют и дикие синантропные птицы, например голуби и воробьи) может давать эволюционные преимущества вирусу, облегчая его распространение.

Рецепторная специфичность H5 вирусов

Повышенный интерес к H5N1 вирусам и необычная рецепторная специфичность тех образцов, который были тестированы в первоначальном исследовании стимулировали нас обследовать рецепторную специфичность широкого набора Н5 вирусов из коллекций США (Department of Virology and Molecular Biology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, Tennessee, и CDC, Atlanta, Georgia). Непатогенные утиные вирусы использовались для сравнения. Мы обследовали представителей нескольких эволюционных ветвей, включавших непатогенные утиные евроазиатские вирусы, американскую линию, включающую вирусы как диких уток так и домашней птицы, и высоко патогенную южноазиатскую линию H5N1 вирусов. Для сравнения, в этих же опытах проставляли ряд других вирусов: ВГ диких уток и человека.

Использовали 9 типов полимеров. Асиаловый 3'-O-Su-Lec, - для контроля; 6`SLN, SLec, Su-SLec, 3`SLN, Su-3`SLN, SLex, Su-SLex и Slea. Ни один из испытанных вирусов не связывал асиаловый сахарид 3'-O-Su-Lec, что доказывает адекватность использованной методики. Как и следовало ожидать, два, взятых для сравнения, человеческих вируса, не связывали ни один из 3`-сиалозидов и хорошо связывали 6`SLN.

Рецепторные фенотипы «первичных» утиных вирусов американской, дальневосточной и юговосточной линий близок к типичному рецепторному фенотипу утиных вирусов прочих субтипов, а именно: сульфатирование не сказывается на связывании рецептора с вирусом, а фукозилирование резко понижает сродство. В эволюционных линиях, адаптирующихся к домашней птице, рецепторная специфичность меняется – возрастает сродство к сульфатированному 3`SLN. Это свойство независимо появляется как в американской, так и Южно-азиатской линии вирусов, и особенно ярко выражено у высоко патогенных H5N1 вирусов.

Вирусы линии, доминирующей в Индонезии, Камбоджи, по-прежнему циркулируют среди домашних птиц. Они приобрели особо высокую патогенность как для кур, так и для млекопитающих, включая человека. У этих вирусов продолжается возрастание сродства к сульфатированным рецепторам, в частности выросло сродство к сульфатированному и фукозилированному рецептору Su-SLex. Напомним, что это же соединение является оптимальным рецептором «вируса куриной чумы» - FPV/Rostok/34 (H7N1). Другая, «китайская» линия H5N1 вирусов характеризуется активным возвратом к диким природным хозяевам: – уткам, гусям и т.д. В этой группе наблюдаются возврат рецепторного фенотипа к исходному. У ряда вирусов сульфатирование не повышает, а понижает сродство к рецептору.

К этой же группе относятся весьма интересные изоляты: Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003. Эти вирусы были выделены от отца и сына, входящих в семейную группу заболевших людей (От других заболевших и умерших не было взято материала для исследования) (Guan et al., 2004). У обоих изолятов резко сдвинутая рецепторная специфичность – они приобрели способность распознавать человеческий рецептор 6`SLN, в то время как сродство к «птичьим» рецепторам у них упало (Shinya et al., 2005; Gambaryan et al., 2006). Сравнение аминокислотных последовательностей рецепторного участка Н5 вирусов выявляет у изолятов Hong Kong/212/2003 и Hong Kong/213/2003, замену Ser227/Asn по сравнению с близкородственными вирусами. Важно отметить, что замена Ser227/Asn не встречается в вирусах, выделеных от птиц, и ее наличие в обоих человеческих изолятах резко усиливает подозрение, что эта мутация произошла в больном человеке, и что дальнейшая передача вируса уже происходила внутри данной семейной группы, от человека к человеку. Такая «сцепка» между сдвигом рецепторной специфичности в сторону распознавания человеческого рецептора и способностью вируса передаваться от человека к человеку может быть рассмотрена как модель формирования пандемического штамма.

Молекулярные механизмы распознавания Su-3`SLN у Н5 вирусов.

Анализ аминокислотных замен у Н5 вирусов помогает понять механизм повышенного сродства к сульфатированным рецепторам. Большинство Н5 вирусов в 193 позиции несут лизин или аргинин – то есть положительно заряженные аминокислоты. Исключениями являются Turkey/Wisconsin/68 и Goose/Vietnam/113/2001, у которых лизин заменен на отрицательно заряженную глютаминовую кислоту. В обоих случаях сродство к сульфатированному рецептору резко падает и становится существенно ниже, чем у несульфатированного аналога (Табл 4).

Таблица. 4 Константы диссоциации Н5 вирусов отличающихся по 193 аминокислоте к сульфатированным и исходным рецепторам.

193 а.о. 3`SLN Su-

3`SLN SLex Su-

SLex SLec Su-

??????oe?/Vietnam/113/2001 H5N1 Asp 5 40 40 >100 3 5

*См подпись под табл. 3.

Повышенным сродством к Su-3`SLN обладают также H3N8 вирусы лошадей с Lys193 в HA (Gambaryan et al., 2004, 2005, 2007). Н7 вирусы, которые также обладают повышенным сродством к сульфатированным рецепторам, тоже содержат Lys в 193 позиции гемагглютинина.

Все эти данные согласуются с нашей гипотезой, что электростатические взаимодействия положительно заряженной аминогруппы лизина или аргинина 193 с отрицательно заряженной сульфогруппой обеспечивают высокое сродство вирусов с Su-3`SLN. (Gambaryan и др., 2004).

Молекулярное моделирование вмещения рецепторов в рецептор-связывающий участок (РСУ) иллюстрирует, почему повышено сродство именно к Su-3`SLN а не к Su-SLec (Рис. 2). Сульфа-группа Su -3`SLN направлена в сторону лизина 193, а у Su-SLec она направлена в свободное пространство.

Рис. 2. Расположение сульфатированных рецепторов Su-SLec и Su-3`SLN в РСУ Н5 вируса. Рецептор вмещен в РСУ гемагглютинина закристализованного в присутствии рецептора LSTa (1JSN, Brookhaven Protein Databank, Ha et al., 2001) путем наложения галактозы Su-SLec или Su-3`SLN на галактозу LSTa. Основная часть рецептора представлена в формате “stick”, за исключением сульфа-группы. Лизин 193 помечен.

Рецепторная специфичность вирусов других субтипов, адаптирующихся к домашней птице.

Сходство рецепторной специфичности высокопатагенных H5N1 вирусов и куриного вируса FPV/Rostok/34 стимулировали нас обследовать рецепторную специфичность вирусов других субтипов, адаптирующихся к домашней птице, в первую очередь тех, среди которых отмечались случаи инфицирования людей.

Результаты анализа вирусов разных хозяев других субтипов представлены в таблице 5.

Из таблицы видно, что разнообразие рецепторных фенотипов у разных птичьих вирусов крайне велико, начиная от типично «утиных» фенотипов, и кончая способностью связывать человеческий рецептор, не хуже, чем птичий. Видно, также, что рецепторные фенотипы зависят скорее от хозяйской принадлежности, чем от субтипа вирусов. Вирусы диких уток 1-го, 2-го, 3-го, 4-го, 5-го, 9-го и 10-го субтипов как и утиные вирусы описанные выше, лучше всего связывают нефукозилированные рецепторы с 1-3 связью между галактозой и последующим звеном: SLeс и STF; не реагируют на сульфатирование рецептора, а фукозилированные рецепторы SLea и SLeх связывают значительно хуже, чем исходные сахариды. Сродство к человеческому рецептору 6`SLN у них исключительно низко.

Близким рецепторным фенотипом обладают вирусы Chicken/14/76, Turkey/England/69, Goose/VN/324/01, Goose/VN/113/01, Turkey/WI/01/1996. В случае Chicken/14/76, Turkey/England/69 и Turkey/WI/01/1996 это может объясняться эволюционной близостью с утиными вирусами. H5N1 вирусы Goose/VN/324/01и Goose/VN/113/01 относятся к группе, безусловно отошедшей от эволюционной ветви, предварительно глубоко адаптированной к курам. Их рецепторный фенотип иллюстрирует повторную адаптацию к птицам отряда Anseriformes. Вирусы шестого субтипа отличаются от утиных вирусов толерантностью к фукозилированию рецептора – сродство к SLeх у них не ниже, чем к 3`SLN. В этом отношении они напоминают вирусы чаек разных субтипов (H4, H5, H6, H13 и H14).

Таблица. 5 Рецепторная специфичность вирусов гриппа домашней птицы

вирусы Субтип

3`SLN Su-

SLex Su-

SLec Su-

Duck/Hong Kong/193/77 H1N2 >5000 10 10 >100 >100 10 10 10 >100

Duck/Hong Kong/717/79 H1N3 >5000 10 10 >100 >100 10 10 10 >100

Duck /Hong Kong/278/78 H2N9 >5000 20 10 >50 >50 10 10 10 >50

загрузка...