Распознавание типа связи между сиаловой кислотой и галактозой(?2-3 vs. ?2-6).

Исследование проводили с помощью рецепторных аналогов 3`SL, 6`SL, 6`SLN и 6`SLN(Gc), пришитых к полимеру, меченному биотином. На рис.1 представлен пример подобного опыта. Полученные данные представлены в виде графиков Скетчарда. Вирус A/Sw/Saskatchewan/18789/02 (H1N1) по всем генам соответствует птичьим вирусам гриппа (“avian-like” вирус), хотя и выделен из свиньи (Karasin et al., 2004) A/Sw/Wisconsin/H03H04/03 (H1N2) несет гемагглютинин классических свиных вирусов, ведущих свое начало со времен пандемии «Испанки» в 1918 году, а A/Sw/Wisconsin/R7C/01 несет поверхностные белки от современных человеческих H3N2 вирусов.

Рис. 1. Графики Скетчарда связывания биотинилированных полимеров, несущих группировки 6`SLN-, 6`SL- и 3`SL- со свиными вирусами: с «классическим свиным» гемагглютинином, с « человеческим» Н3 гемагглютинином и с «аvian-like» гемагглютинином.

Из рисунка видно, что “avian-like” вирус связывает все три типа рецепторов (3`SL, 6`SL, 6`SLN), причем лучше всего – первый из них, отличаясь от птичьих вирусов только принципиальной возможностью связывать 6`SL и 6`SLN рецепторы. Два других вируса связывают только рецепторы с сиалил2-6галактозной связью, причем 6`SLN существенно лучше, чем 6`SL.

Такой характер связывания типичен для современных ВГ человека (Gambaryan et al., 1997 and 1999; Mochalova et al., 2003), но до сих пор не был описан для свиных вирусов. Во всех предыдущих исследованиях у свиных вирусов регистрировали «двойную» рецепторная специфичность (Rogers and D`Souza, 1989; Gambaryan et al., 1997; Matrosovich et al., 1997, 2000; Маринина и др., 2004). Однако во всех этих исследованиях работали со свиными вирусами, изолированными на куриных эмбрионах, в отличие от вирусов, использованных в этом исследовании.

Для прояснения картины мы протестировали с помощью пяти вышеупомянутых меченных рецепторных аналогов четыре группы свиных вирусов, а именно:

Изолированные на клетках МДСК вирусы с «классическим» свиным ГА

Изолированные в куриных эмбрионах вирусы с «классическим» свиным ГА

Изолированные на клетках МДСК вирусы с Н3 ГА человека.

Изолированные на клетках МДСК “avian-like” вирусы с Н1 и Н3 ГА.

Для сравнения использовали два типичных птичьих вируса A/Duck/Hong Kong/717/79 (H1N3) и A/Duck/Alberta/35/76 (H1N1).

Из таблицы 3 видно, что

Никакие из вирусов, кроме “avian-like” Н3, не распознают 6`SLN(Gc) – рецептор. Это противоречит гипотезе Ito (1998), что свиные вирусы адаптируются в гликолильной форме сиаловой кислоты – доминирующей на сиалохаридах дыхательного тракта свиньи.

Утиные вирусы распознают только 3`SL рецепторы – в составе фетуина и полимера.

Вирусы, выделенные на куриных эмбрионах, хорошо связываются с фетуином и распознают как «человеческий» так и «птичий» рецепторы, в полном согласии с ранее опубликованными данными (Rogers and D`Souza, 1989; Gambaryan et al., 1997; Matrosovich et al., 1997, 2000; Маринина и др., 2004).

Такой же рецепторной специфичностью обладают и “avian-like” вирусы с Н1 и Н3 ГА изолированные на клетках МДСК.

Таблица 3. Константы диссоциации комплексов вирусов с фетуин-пероксидазой и с биотинилированными полимерами (1000 kD), несущими сиалосахаридные остатки.

С «классическим свиным» НА, изолированные на куриных эмбрионах

Sw/Iowa/1976/31 H1N1 0.03 0.03 0.2 0.05 >5

Sw/Indiana/1726/88 H1N1 0.05 0.05 0.15 0.05 >5

Turkey/Kansas/4880/80 H1N1 0.03 0.1 0.4 0.2 >5

«человеческие», выделенные от свиней, изолированные на МДЦК

Sw/Wisconsin/HO3HB4/03 H3N2 >1 >5 0.04 0.01 >5

Sw/Wisconsin/R5E/01 H3N2 >1 >5 0.1 0.02 >5

Sw/Wisconsin/R5I/01 H3N2 >1 >5 0.3 0.04 >5

Sw/Wisconsin/R6H/01 H3N2 >1 >5 0.5 0.1 >5

Sw/Wisconsin/R7C/01 H3N2 >1 >5 0.3 0.03 >5

Sw/Wisconsin/RP5G/01 H3N2 >1 >5 0.5 0.1 >5

«Avian-like», выделенные от свиней, изолированные на МДЦК

Sw/Saskatchewan/18789/02 H1N1 0.01 0.02 0.1 0.05 >5

Sw/Ontario/K0477/01 H3N3 0.03 0.01 0.1 0.1 1

Sw/Ontario/42729/01 H3N3 0.03 0.01 0.1 0.1 1

Утиные вирусы, изолированные на куриных эмбрионах

Dk/Hong Kong/717/79 H1N3 0.03 0.02 >1 >1 >5

Dk/Alberta/35/76 H1N1 0.05 0.03 >1 >1 >5

*Для вирусов гриппа А обозначение А/ в названии опущено.

Sw – swine, Dk – duck, Ch - Chicken

** мкМ по сиаловой кислоте

Приводятся усредненные данные трех опытов; стандартная ошибка не превышает 50% от представленных величин

Все вирусы первой и третьей группы, обладают рецепторной специфичностью, типичной для человеческих ВГ. Они совершенно не распознают 3`SL рецептор. H3N2 вирусы, как и современные человеческие H3N2, не связывают фетуин; H1N1 и H1N2 сохранили небольшую способность связывать фетуин, что, опять же, характерно для человеческих H1N1 вирусов.