Neu5Ac(2-8 Neu5Ac(2-3 GD1b

Neu5Ac(2-3Gal(1-3GalNAc?1-4

Gal?1-4Glc-cer

Neu5Ac(2-8 Neu5Ac(2-3 GT1b

Все исследованные сахара, кроме STn и 3,6-STn – природные соединения.

Контрольный асиаловый полимер, а так же полимеры, несущие группировки Neu5Gc?, 3,6-STn и (Sia)3 не связывались ни с какими из вирусов. Сродство к 3`SLN- и 3`SL-группировкам было, в пределах точности измерения, равным для всех испытанных вирусов.

Проведенное исследование показало, что рецепторная специфичность разных вирусов гриппа птиц не совпадает. Общность птичьих вирусов ограничивается только распознаванием 2-3 связи между сиаловой кислотой и последующей галактозой. Разные вирусы нацелены на разные природные сиалосодержащие группировки. Причем можно отметить как отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вируса, так и особенности, присущие субтипам.

Способность вирусов связывать гликолильную форму сиаловой кислоты изучали с помощью полимеров 3`SLN и 3`SLN(Gc). Все исследованные Н3 и Н7 вирусы связываются с 3`SLN(Gc) почти так же хорошо, как и с 3`SLN. Это свойство не коррелирует с хозяйской принадлежностью вирусов, так 3`SLN(Gc)-группировку хорошо связывают вирусы уток, свиней, лошади, кур и тюленя Н3 и Н7 субтипов. В то же время вирусы других субтипов 3`SLN(Gc) не связывали.

Ни один из вирусов не связывался с р(Sia)3, в котором сиаловая кислота присоединена не к галактозе, а к восьмому кислороду другой CK. Этот результат лишний раз доказывают, что минимальной рецепторной группировкой вирусов гриппа птиц является не просто сиаловая кислота, а сиалил2-3 галактоза.

Т2Роль третьего сахаридного звена в связывании рецептора с вирусом видна из сравнения сродства к SG, 3`SL,3`SLN, SLec и STF. Большинство вирусов примерно одинаково хорошо связывается с SG, 3`SL и SLN. Это свидетельствует о том, что сахаридное кольцо, присоединенное к ? галактозе 1-4 связью, направлено в раствор и не принимает активного участия в связывании. В SLec и STF третье звено присоединено к галактозе 1-3 связью. Сродство к этим группировкам у всех вирусов близкое, следовательно, направление гидроксильного остатка при четвертом углероде третьего сахаридного звена не принципиально для связывания.

Сродство к STF у вирусов уток, как правило, выше чем к SLN, то есть эти вирусы адаптированы к 1-3 связи между вторым и третьим звеном сахаридной цепочки. Вирусы цыплят, напротив, лучше связывают 3`SLN чем STF, то есть они адаптированы к 1-4 связи между галактозой и последующим звеном.

У вирусов чаек соотношение сродства к 3`SLN и STF зависит от субтипа. У ВГ субтипа Н13 выше сродство к 3`SLN, а у Н4, H6 и Н14 вирусов, которые недолго циркулировали в чайках, как и у близкородственных вирусов уток, выше сродство к STF.

Заместители при третьем звене сахаридной цепочки влияют на связывание разных вирусов по разному, и могут как понижать, так и повышать сродство к рецептору.

Фукозилирование третьего от конца глюкозамина резко понижает сродство рецептора к большинству утиных вирусов. В отличие от вирусов уток, у всех исследованных нами вирусов чаек, относящихся к пяти субтипам, сродство к фукозилированному SLex не ниже, чем к исходному 3`SLN. Для специализированных к чайкам вирусов субтипа Н13 SLex является одной из оптимальных рецепторных группировок.

Столь же резкие отличия, связанные с хозяйской принадлежностью вирусов, наблюдаются и в отношении к сульфатированным по шестому положению третьего звена рецепторам. Для большинства тестированных нами утиных вирусов наличие этой группировки не сказывается на связывании. Но для вирусов цыплят, свиней, вируса лошади и вируса тюленя сульфатирование повышает сродство к определенным типам рецепторов. Так, резко повышено сродство к Su-3`SLN у Н5 вирусов кур и у Н3 вируса лошади, а у всех свиных вирусов и у Н7 вирусов кур и тюленя резко повышено сродство к Su-SLex.

Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на то, что птичьи вирусы гриппа, как правило, распознают Sia2-3Gal, они могут отличаться по способности распознавать последующие сахаридные звенья рецептора. Из этого следует, что разные виды птиц могут отличаться по способности генерировать вирусы, потенциально опасные для человека.

Рецепторная специфичность вирусов гриппа чаек

До наших исследований вирусы гриппа уток и чаек характеризовались как единая группа, которую было принято называть вирусами диких водоплавающих птиц (wild aquatic birds) (Alexander, 2000; Webster and Bean, 1998). В 1997 году было показано, что Н13 вирусы чаек отличаются от вирусов уток других субтипов тем, что их сродство к 3`сиалиллактозе не выше, чем сродство к свободной к ?-нейраминовой кислоте (?Neu5Ac). Иными словами, если для утиных вирусов минимальной рецепторной детерминантой является Sia2-3Gal, то для Н13 вирусов вклад галактозы в связывание не существенен (Matrosovich et al., 1997). Для более детального сравнения вирусов чаек с типичными представителями вирусов уток мы определили сродство этих вирусов к ?Neu5Ac, к 3`сиалиллактозе, и к полимерным гликоконьюгатам, несущим группировки: 6`SLN, 3`SLN, SLex, SLea и SLec.

Все исследованные вирусы гриппа чаек, так же как и вирусы уток, адаптированы к ?2-3-связанной сиаловой кислоте. Однако структура оптимального рецептора для вирусов уток и чаек различается. Общим свойством всех тестированных вирусов чаек, с гемагглютининами H4, H5, H6, H13, H14 и H16 субтипов является высокое сродство к фукозилированным рецепторам.

Для вирусов чаек 4, 5, 6 и 14 субтипа оптимальным рецептором является SLea, то есть у них сохраняется характерное для утиных вирусов предпочтение рецепторов, основанных на дисахариде Gal1-3GlcNAc. У вирусов субтипов Н13 и Н16 сродство к 3`SLN выше чем к Sleс, а сродство к Sleх выше чем к Sleа. Т.е. они лучше распознают рецепторы, основанные на дисахариде второго типа (Gal1-4GlcNAc).

Повышенное сродство к фукозилированным рецепторам у вирусов чаек сопровождается перестройкой 222-228 петли гемагглютинина (Табл. 2). У Н13 вирусов заменены консервативные Val223 и Gly228; крупная аминокислота в 222 позиции заменена на мелкую, и мелкая в 227 позиции – на крупную.

Таблица 2. Сравнение строения 222-228 петли гемагглютинина утиных вирусов и вирусов чаек субтипов Н13, Н16, Н6 вирусов и вируса А/Чайка/ Москва/3100/2006 (Ч/Moсква) (H6N2)

№ аминокислот 222 223 224 225 226 227 228

Консенсус HA

вирусов уток Lys, Pro, Аrg, Leu, Gln, Trp Val Asn

Arg Gly Gln Ala, Gly, Ser Gly

HA H13 Gly Tyr Asp Gly Gln Arg, Lys Ser

HA H16 Gly - Asp Gly Gln Arg Ser

Консенсус HA Н6 Ala Val Asn Gly Gln Arg Gly

HA Ч/Москва Ala Val Ser Gly Gln Arg Gly

Гемагглютинин 16 субтипа без сомнения происходит от 13 субтипа, так как в нем сохранены все замены, характерные для 13 субтипа. Однако там возникли новые, еще более «радикальные» замены (Tyr98/Phe, Ala138/Ser, Glu190/Tre и делеция 223 аминокислоты). В результате рецепторный фенотип вирусов 16 субтипа оказался совершенно необычным. Интересно, что к ним вернулась утраченная у Н13 вирусов способность связывать 3`SL с более высоким сродством, чем ?Neu5Ac что указывает на существенный вклад галактозы в связывание. Сродство к мономерной 3`SL высокое, но при этом сродство к заякоренным на полимере рецепторам низкое. Максимальное сродство – к SLex. Возможно оптимальная рецепторная группировка для Н16 вирусов в ее природном «контексте» нами еще не найдена.

H6N2 вирус А/Чайка/ Москва/3100/2006, выделенный нами из фекалий чайки осенью 2006 на Московском пруду в Тропарёво, связывает фукозилированные Slex и Slea значительно лучше, чем исходные соединения.

По сравнению с «консенсусом» утиных вирусов, у Чайка/ Москва/3100, как и у всех Н6 вирусов в 222 позиции вместо массивной аминокислоты стоит Ala; помимо этого по сравнению с консенсусом Н6 вирусов имеется еще одна замена Asn224/Ser (табл. 2). Сочетание этих замен как раз там, куда направлена группа фукозы, создает, вероятно, особо благоприятные условия для связывания фукозилированных рецепторов.

На примере Н4 вирусов видно, что характерная способность распознавать SLex не хуже, чем 3`SLN появляется немедленно после переход утиных вирусов к чайкам. Так, в верхушечной части гемагглютинин вируса Крачка/Бурятия/1901/00 (H4N6) отличается от вируса Утка/Бурятия /1905/00 (H4N6) единственной аминокислотной заменой Ser205/Pro, однако измененный «чаячий» рецепторный фенотип у него уже сформирован. Ser205 тесно зажат между несколькими участками цепей гемагглютинина. С одной стороны он прижимается к гидрофобному "узлу" составленному из Val204, Leu243, Ile245 и Trp180 Trp. Важно подчеркнуть, что 204 и 180 аминокислоты константны для всех субтипов, а в 204 и 243 позиции постоянна гидрофобная аминокислота.

С другой стороны Ser205 вклинивается между Arg220 и Pro221 соседней субъединицы гемагглютинина. Обе эти аминокислоты константны для всех субтипов. Это позволяет нам утверждать, что структура данного участка консервативна. Замена маленького серина на более крупный пролин, который, к тому же, вносит излом в белковую цепь, должна сильно нарушить локальную структуру гемагглютинина. Подвижки 220 и 221 аминокислот неизбежно вызовут смещения контактирующих с ними 222, 229, 228 и 226 аминокислот. 222 аминокислота, как следует из данных приведенных ниже, играет ключевую роль во взаимодействии с фукозой. Очевидно, именно вследствие этой перестройки фукоза в группировках Slex и Slea перестает препятствовать связыванию.

Вирусы чаек 14-го субтипа по рецепторным свойствам напоминают вирусы чаек четвертого и шестого субтипов – максимальное, причем высокое сродство к SLeа. Этот рецепторный фенотип характерен для ВГ чаек тех эволюционных ветвей, которые совсем недавно отделились от утиных вирусов и, возможно, сохраняющих способность инфицировать уток. Имеются и утиные изоляты с таким же рецепторным фенотипом – Шилохвость/Приморье/695/76 (H2N3), Кряква/Гурьев/244/82 (H14N6). Возможно – это вирусы «смешанных» очагов, где утки и чайки живут в близком соседстве и обмениваются вирусами.

Подводя итог, можно сказать, что самым общим и самым постоянным свойством вирусов чаек является их способность связывать фукозилированные рецепторы. Такое свойство не могло возникнуть случайно и независимо в большом числе эволюционных линий, и оно явно свидетельствует о том, что при переходе от уток к чайкам вирус адаптируется к новому, фукозилированному рецептору.

Рецепторная специфичность вирусов гриппа свиней

Сравнительное сродство вирусов свиней к клеткам мишеням утки, свиньи и мартышки

Изменение рецепторной специфичности вирусов гриппа при смене хозяина по всей вероятности должна повышать сродство вирионов к новой хозяйской клетке, то есть при переходах вируса от уток к свиньям и к людям можно ожидать соответствующих изменений рецепторных фенотипов. Для проверки этого положения, мы сравнили способность вирусов связываться с плазматическими мембранами эпителиальных клеток кишечника утки, трахеи свиньи и трахеи зеленой мартышки. Вирусы уток хорошо связываются со всеми тремя субстратами. Вирусы свиней связываются с мембранами клеток кишечника утки хуже, чем утиные вирусы. Для них падает доля подходящих рецепторов на клетках кишечника утки. H1N1 вирусы человека практически перестают связываться с клетками кишечника утки. Вирусы свиней лучше всего связываются с мембранами из трахеи свиньи, а вирусы человека – с мембранами из трахеи мартышки. Это указывает на то, что состав сиалосахаридов на этих трех типах клеток не совпадает и вирусы приспособлены к рецепторам своих хозяйских клеток. Для детализации рецепторного фенотипа ВГ свиней мы воспользовались полимерами, несущими разные рецепторные аналоги.