По-видимому, обнаружение на слизистой носоглотки детей капсульных штаммов серовара «b» I, II, III биоваров является потенциально опасным в связи с тем, что эти биоварианты и сероварианты чаще вызывают первично-локализовнные и инвазивные H.influenzae-инфекции.

Рис. 8. Частота выделения биовариантов при различных инфекциях , вызванных H.influenzae. По оси абсцисс - биовары, по оси ординат -частота выявления биоварианта(I,II, III, V, VI, VII, VIII ) в % при:1) первично-локализованных инфекциях; 2)при инвазивных инфекциях.

При тестировании 268 штаммов H.influenzae к антибактериальным препаратам выявлены фенотипы резистентности, отличающиеся у нетипируемых и капсульных штаммов. В табл. 2 показаны фенотипы резистентности к ?-лактамным антибиотикам нетипируемых штаммов H.influenzae, выделенных в 200-2005 г.г. Преимущественно распространены штаммы, не продуцирующие ?-лактамазу, и чувствительные к ампициллину. Появление небольшого количества штаммов, продуцирующих ?-лактамазу и резистентных к ампициллину (5,1%), ?-лактамазанегативных, резистентных или умеренно резистентных к ампициллину (3,6%), свидетельствует о возможном распространении штаммов с разными механизмами резистентности.

Таблица 2

Частота выявления фенотипов резистентности к ?-лактамам

у нетипируемых штаммов H.influenzae

Название фенотипа резистентности Количество штаммов Частота в %

1) ?-лактамазонегативные (BLNAS), чувствительные к ампициллину 178 91,3

2) ?-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (BLPAR) 10 5,1

3) ?-лактамазонегативные ампициллинорезистентные, (BLNAR) 5 2,56

4) ?-лактамазонегативные умеренно резистентные к ампициллину (BLNAI) 2 1,02

Всего 195 100

Нетипируемые штаммы, выделенные в течение 2000-2005г.г. были резистентны к цефалоспоринам 1 поколения; к цефуроксиму и цефаклору - 4,4%; чувствительны к ампициллину -79,2). ?-лактамазы обнаружены у 5,1%. Не наблюдалось увеличения количества резистентных штаммов за последние пять лет к хлорамфениколу, тетрациклину, рифампицину, к фторхинолонам. Выявлено увеличение резистентных к триметоприм/сульфаметоксазолу нетипируемых штаммов (10,9%). 2,6% исследованных штаммов являются ?-лактамазо-негативными, ампициллинорезистентными; 1% - ?-лактамазонегативными, умеренно резистентными к ампициллину. Штаммы серовара «b», выделенные при инвазивных формах инфекции, были резистентны к цефалоспоринам I поколения, чувствительны к другим цефалоспоринам, ампициллину, хлорамфениколу. Результаты резистентности к антибактериальным препаратам показаны на рисунке 9.

- чувствительные.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствованные и разработанные микробиологические методы позволяют увеличить выявление гнойно-септических инфекций, вызываемых H.influenzae, и выявить распространение фенотипов H.influenzae у больных и здоровых детей.

2. Доказаны и успешно реализованы диагностические возможности авторских питательных сред - ЭрДС, двухфазной, транспортной, и способа выделения H.influenzae со слизистой носоглотки, что позволило на 28% увеличить выделение возбудителя при первично-локализованных инфекциях и в три раза при инвазивных H.influenzae-инфекциях. Доказана необходимость контроля ростовых свойств питательных сред и определены критерии, предъявляемые к тест-штамму Н.influenzaе. Диагностическая эффективность разработанных культуральных методов позволила определить роль H.influenzae в структуре гнойных менингитов.

3. Диагностические препараты, полученные из типоспецифических капсульных кроличьих сывороток «a», «b», «c», «d», «e», «f», применимы для серотипирования капсульных штаммов в реакциях ко-агглютинации, латекс-аглютинации и наиболее специфичны в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

4. Разработанная тест-система ИФА, являющаяся специфичной и чувствительной (10-20 нг растворимого антигена в 1 мл), позволяет выявлять капсульный полирибозилфосфат H.influenzae в ликворе в течение 3 ч и увеличить этиологическое подтверждение на 29%.

5 Инвазивные Н.influenzaе-инфекции - менингит, сепсис, септическая пневмония, гематогенный остеомиелит вызваны биоварами I, II, III сероваров «b», «d»; первично-локализованные (отит, синусит, коъюнктивит, хронические заболевания легких) – нетипируемыми по капсуле биоварами, чаще I, II, III (63,5%), реже - VII, VIII (30,6%).

6. Показана диагностическая ценность обнаружения сероконверсии IgG-антител к белкам наружной мембраны бескапсульных штаммов Н.influenzaе у больных с хроническими заболеваниями лёгких. Двух-трех-кратное увеличение уровня IgG-антител при выделении возбудителя в концентрации103 КОЕ/мл из жидкости бронхо-альвеолярного лаважа или в концентрации105 КОЕ/мл из мокроты может свидетельствовать об обострении инфекции. При выявления IgG-антител к капсульному полирибозилфосфату «b» у больных гнойным менингитом в тест-системе ИФА не отмечено положительной сероконверсии, в отличии от больных пневмонией, вызванной сероваром «b».

7. Среди фенотипов назофарингеальных штаммов, выделенных от здоровых (первой группы здоровья) детей, выявлены преимущественно нетипируемые, бескапсульные штаммы VIII биовара. У детей, относимых к другим группам здоровья, выявлены как нетипируемые, бескапсульные штаммы I, II, III, VII, VIII биоваров, так и капсульные серовары «a», «b», «c», «d», «f», выделенные не более, чем у 1% обследованных. Частота выявления фенотипов зависит от возраста, сезона, группы здоровья детей и составляет от 12 до 36% обследованных.

8. В течение 1986-2005 гг. в Екатеринбурге H.influenzae «b»-менингит встречался у 2-9% среди всех детей, переболевшим гнойным менингитом, чаще у детей до 3 лет, и у 20% детей среди больных до 5 лет. H.influenzae-менингиты занимают второе - третье место после менингококковых. Увеличения частоты H.influenzae «b»-менингитов у детей за исследованный период не отмечено. Среди инвазивных инфекций, вызванных H.influenzae «b», менингиты составляют 81,1%, септическая пневмония, фульминантный сепсис, остеомиелит – по 6,3%.

9. В структуре гнойно-септических инфекций у детей первично-локализованные формы, вызванные H.influenzae, составили: при среднем отите - 7%, при воспалении околоносовых пазух - 18,1%, при конъюнктивите-5,5%, при хронических инфекциях лёгких - 8,3%. При хронических инфекциях лёгких, кроме нетипируемымых штаммов, выделены серовары «d» и «b».

10. Фенотипы резистентности среди нетипируемых H.influenzae, вызвавших первично-локализованные, и штаммов серовара «b», вызвавших инвазивные инфекции, существенно отличаются.

11. Нетипируемые штаммы H.influenzae, выделенные в течение 2000 – 2005 г.г., были резистентны к цефалоспоринам 1 поколения; к цефуроксиму и цефаклору - 4,4%; чувствительны к ампициллину -79,2%; ?-лактамазы обнаружены у 5,1%. В 2,5% среди нетипируемых H.influenzae обнаружены ?-лактамазо-негативные ампициллинорезистентные штаммы (BLNAR).

12. Штаммы H.influenzae серовара «b», выделенные при инвазивных формах инфекции, резистентны к цефалоспоринам I поколения, но чувствительны к другим цефалоспоринам, а также к ампициллину и хлорамфениколу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения результативности диагностики инфекций, в этиологии которых имеет место H.influenzae, необходимо проводить исследование всех возможных биосубстратов при различных формах инфекции, в том числе материала аутопсий, с использованием двухфазной питательной среды ЭрДС при исследовании стерильных полостей, и плотной среды ЭрДС - при других локализациях гнойно-воспалительного процесса.

Для контроля качества питательных сред необходимо использовать 18-часовую культуру H.influenzae, выращенную при +37?С в атмосфере СО2 с типичными биохимическими с антигенными свойствами без признаков диссоциации и наличия не более 10% удлинённых клеток размером > 5,0 мкм. Качественной можно считать плотную питательную среду для выделения H.influenzae из клинического материала, если при посеве 0,1 мл из разведения 10-7 КОЕ обнаружен рост десятков колоний.

Индикация капсульного антигена H.influenzae «b» различными методами повышает информативность исследования, но не заменяет культуральные методы выделения других (не серовара «b»), сероваров H.influenzae, поэтому культуральное исследование обязательно при диагностике всех случаев инфекций у детей

Использование предлагаемых питательных сред, приготовленных с использованием эритроцитарной массы из крови человека, дрожжевого экстракта, сыворотки крови крупного рогатого скота, вполне доступно для практических лабораторий.

Применение двуфазной среды ЭрДС для посевов материала из стерильных полостей ускоряет выделение и идентификацию культуры и позволяет выделить из стерильных полостей в минимальных количествах не только H.influenzae, но и другие прихотливые бактерии.

Определение биовара штаммов H.influenzae, являющееся легко выполнимым, позволяет выявить потенциально опасные биовары (I, II, III), чаще вызывающие инвазивные гнойно-воспалительные заболевания. Сероварирование препаратами к капсульным полисахаридам позволяет выявить штаммы разных сероваров, имеющих значение в инфекционной патологии у детей.

Для определения антибиотикорезистентности в практических лабораториях вполне применимы хромогенный тест выявления ?-лактамаз, дискодиффузионный метод на НТМ-агаре, а также использование автоматических систем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Боронина Л.Г. Новые методы культивирования гемофильных бактерий / Л.Г. Боронина, С.А. Журов // Тезисы докладов конференции «Разработка и использование новых методов диагностики, лечения и профилактики». – Свердловск, 1986. – С. 74.

Боронина Л.Г. Серотипирование Н.influenzae в реакции иммунофлуоресценции / Л.Г. Боронина, С.А. Журов, Е.С. Ворошилина // Тезисы докладов конференции «Разработка и использование новых методов диагностики лечения и профилактики». – Свердловск, 1987. – С. 102.

Боронина Л.Г. К вопросу совершенствования микробиологической диагностики Н.influenzae при гнойных менингитах у детей / Л.Г. Боронина, С.А. Журов, Л.И. Лисицина // Всесоюзная конференция «Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике», 21-22.06.1988 г., том 1. – С. 61-62.

Боронина Л.Г. Определение антител Н.influenzae типа «b» в сыворотке крови у детей с гнойными менингитами иммуноферментным методом / Л.Г. Боронина, В.Б. Сбойчаков, И.И. Волков // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. посвященной 60-летию Пермского НИИ вакцин и сывороток «Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактерийных препаратов». – Пермь, 1988. – С. 211-213.