Основным условием успешного бактериологического исследования является применение высокоэффективных питательных сред для H.influenzae, содержащих «Х» и «V» факторы роста. Сравнительное изучение показателей чувствительности разных сред, приготовленных на основе доступных ингредиентов по принципу «шоколадного» агара с использованием крови человека, свидетельствует о низких показателях выявления H.influenza. Изучение возможных вариантов питательных сред на различной основе с использованием видов крови различных животных и человека, а также термической обработке, позволяет сделать вывод о наиболее высокой эффективности питательных сред с добавлением крови кролика и термической обработки при 75-80?С, что соответствует данным других авторов (Храмова Н.И,1975). Использование этого режима для приготовления сред с кровью человека значительно снижает чувствительность среды за счёт разрушающего действия анти-V-фактора и других возможных ингибиторов крови человека. При термической обработке при 100?С разрушается анти-V-фактор. При этом разрушаетcя и большая часть V–фактора, недостаток которого не позволяет расти H.influenzae без микроорганизмов-саттелитов.

Учитывая трудности практических лабораторий в приобретении крови кролика и дефибринированной крови человека, нами разработан способ приготовления среды оптимального состава. Стандартною эритроцитарную массу, полученную из крови человека, приготовленную в соответствие со стандартными технологиями, принятыми при приготовлении препаратов крови без цитрата натрия, нагревали до 80?С, затем добавляли дрожжевой экстракт и сыворотку крупного рогатого скота. Сравнительная оценка питательных сред по показателю экстинции (Ext), показанная на рисунке 1, свидетельствует о высокой эффективности жидкой среды из крови кролика (среда №2): минимальное значение логарифмической фазы роста (tлаг=0,45), при времени регенерации (Gmin=0,87), максимальное значение удельной скорости роста (Mmax=0,7).

Увеличение длительности лог-фазы и минимального времени генерации свидетельствует о меньшей эффективности среды, приготовленной из эритроцитарной массы крови человека (среда № 1 – ЭрДС) по сравнению со средой из крови кролика, но значительно превосходит по эффективности среды из крови человека (на рис. 1 – среда №3). Чувствительность среды «H.influenzae-ЭрДС-агар» (Эр – эритоцитарная масса, Д – дрожжевой экстракт, С – сыворотка крупного рогатого скота) составила 106 - 107 КОЕ /мл.

Рис. 1. Оптическая плотность культуры H.influenzae на различных жидких питательных средах. По оси ординат – значения оптической плотности, выраженные в lg (Ext t*100) при 540 нм, по оси абсцисс – время взятия пробы.

1) среда ЭрДС, 2) среда с кроличьей кровью, 3) среда с кровью человека.

По изложенному принципу готовится и «двухфазная» среда, где плотной фазой служит среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного агара, а жидкой – жидкая питательная среда ЭрДС, приготовленная на основе питательного бульона, осветлённая при центрифугировании.

Использование «двухфазной» среды для посева материала позволило выделить возбудителей из стерильных локусов при менингите и сепсисе в 2,1 раза чаще, чем при использовании традиционных сред, рекомендованных приказами МЗ № 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98. Применение «двухфазной» среды ЭрДС имеет следующие преимущества перед использованием первичных посевов на пластинчатые среды:

в зависимости от количества возбудителя в материале существенно ускоряется первый этап выделения культуры – в течение 3 – 4 – 6 часов;

прозрачность плотной и жидкой фазы упрощает визуальные исследования;

микроскопия мазка из жидкой фазы, окрашенного по Граму и Бурри-Гинсу, увеличивает информативность в изучении морфологии бактерий;

культура, выросшая в жидкой среде, может использоваться для реакции агглютинации при сероидентификации и определения биовара;

осадок, полученный после центрифугирования из жидкой фазы, может быть использован для ускоренного выявления ?-лактамаз в хромогенном тесте, что способствует ранней этиотропной антибиотикотерапии;

культура может быть использована для определения резистентности к антибиотикам методом диффузии в агар.

Важным является также то, что «двухфазная» среда ЭрДС предлагаемого состава и способа приготовления, является пригодной для выделения других прихотливых возбудителей. Так, с помощью ЭрДС «двухфазной» среды удалось выделить из ликвора как H.influenzae, так и N.meningitidis и S.pneumoniae.

Полученные по оригинальной схеме типоспецифические капсульные сыворотки к полисахаридам H.influenzae «а», «b», «с», «d», «е», «f», в реакции агглютинации имели титр специфических агглютининов от 1:1024 до 1:25600. В развернутой реакции агглютинации все типовые сыворотки агглютинировали с гетерологичными капсульными бактериями не более чем на 1/4 титра специфических антител. С целью устранения гетерологичных антител применяли прогревание и истощение гетерологичными капсульными штаммами H.influenzae.

Чувствительность и специфичность полученных диагностических капсульных сывороток определяли в реакции агглютинации и в реакции преципитации с штаммами H.influenzae. Чувствительность латексного препарата H.influenzae «b» определяли в агглютинации с полирибозилфосфатом (ПРФ). Чувствительность при индикации ПРФ, полученного из H.influenzae «b» составила 12,5 нг/мл, при определении сероварианта культур в реакции агглютинации латекса составила 5х105 КОЕ/мл. Чувствительность РНИФ при определении сероваров штаммов – 5х102 КОЕ/мл.

При использовании диагностических препаратов в реакции агглютинации, латекс-агглютинации, РНИФ сероварировали 348 штаммов H.influenzae, выделенных из различных мест локализации, 21,8% штаммов которых имели капсулу, из них 78,8% штаммов отнесены к серовару «b», 1,3% - к серовару «а», 1,1% - к серовару «с», 11,0% - к серовару «d», 9,7% - к серовару «f».

Из крови при гнойном менингите, септицемии выделены H.influenzae «b» - 12 штаммов, из ликвора H.influenzae «b» - 31, при остеомиелите из крови - 1 штамм серовара «b»; при деструктивной пневмонии из крови - 1 штамм H.influenzae «d», при септической пневмонии из крови штамм серовара «b» -1; при фульминантном сепсисе из материала аутопсии - 4 штамма H.influenzae «b».

При первично-локализованных инфекциях выделены: при гнойном синусите из материала пункции пазух - 22 нетипируемых штамма H.influenzae; из отделяемого при конъюнктивите 19 штаммов нетипируемых H.influenzae; из раны при воспаление орбиты глаза - 1 штамм, из мокроты при острой пневмонии – 27 нетипируемых и 1 штамм H.influenzae «b».

Из мокроты детей с хроническими заболеваниями лёгких выделено 52 штамма, из них 5 штаммов капсульных («b»-2, «d»-1, «f»-2); из материала бронхоальвеолярноного лаважа выделено 48 штаммов, из них 6 капсульных («b» - 2, «d» - 2, «f» - 2); при хроническом пиелонефрите из мочи 4 нетипируемых штамма, при вульвите из отделяемого со слизистой вульвы-3 нетипируемых штаммов H.influenzae

Результаты ИФА по определению H.influenzae серовара «b», выраженные в величинах оптической плотности (ОП), во всех случаях находились в прямо пропорциональной зависимости от концентрации изучаемых антигенов, представлены результаты определения разрешающей способности тест-системы по выявлению Н.influenzaе «b». Минимальная концентрация Н.influenzaе (нижний уровень детекции), выявляемая с помощью «сэндвич»- метода ИФА составила 7х104–105 КОЕ/мл. Для определения воспроизводимости метода и стабильности реакции использовали контрольные штаммы Н.influenzae «b»: штамм «b» 11/64, 94505/80 и штаммы 98 «b» и 99 «b», выделенные из ликвора и крови больного. Небольшие вариации оптической плотности были получены при исследовании одинаковых количеств Н.influenzae «b» разных штаммов. Проведенные на основании полученных данных расчеты показали, что ошибка количественного определения клеток указанных штаммов при использовании Н. influenzae II/64 «b» в качестве стандарта не превышает 15%, т.е. находится во вполне допустимых пределах. Различия коэффициентов вариации и дисперсий оптической плотности результатов реакции по определению разных штаммов свидетельствуют о недостоверности различий (р<0,05), поэтому результаты обнаружения Н.influenzae «b» при помощи диагностической тест-системы можно считать воспроизводимыми и стабильными. Диагностическая тест-система «сэндвич» варианта ИФА позволяет обнаружить 10-15 нг/мл растворимого липополисахаридного антигена Н. influenzae.

Контроль специфичности разработанной тест - системы осуществляли двумя способами: реакцией торможения и при постановке реакции с гетерологичными антигенами. Реакцию торможения проводили на стадии взаимодействия антигенов с иммобилизованными антителами, добавляя в реакционную смесь те же антитела в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Наибольшую специфичность предложенного варианта «сэндвич-ИФА» по индикации Н.influenzae определяли при исследовании бактерий различных групп, которые имеют общие антигены с Н.infiuenzae или могут встречаться в тех биологических субстратах, которые предстоит исследовать для обнаружения антигенов Н.influenzaе.

Для определения чувствительности и специфичности разработанной системы ИФА по выявлению антигенов H.influenzae сероварианта «b» провели серию опытов со штаммами микроорганизмов разных видов и родов. Результаты исследований по определению специфичности тест-системы, показанные на рис. 2, свидетельствуют, что другие бактерии не выявляются в максимальной концентрации 5х107 КОЕ/мл.

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х106 КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других серовариантов (в большей степени сероварианта «с») незначительна, поэтому в концентрациях 104-105 КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено.

Рис. 2. Определение специфичности тест-системы «сэндвич»-варианта ИФА в чистых и смешанных бактериальных культурах. По оси абсцисс - концентрация бактериальных клеток КОЕ/мл (х104), по оси ординат – оптическая плотность при 450 нм. 1-H. influenzae «b» II/64; 2-E. cоli + H. influenzae «b» II/64; 3-S. pneumoniae 6A; 4-P. aeruginosa I; 5-K. pneumoniae; 6-Y. enterocolitica; 7-N. meningitidis «C».

Сравнение результатов индикации Н. influenzae «b» в концентрации 5х105 с сероваром «с» в концентрации 107 КОЕ/мл и сероваром «f» в концентрации 2х106 КОЕ/мл показало (рис. 2), что разница в оптической плотности с учетом коэффициента вариации и различия дисперсий не достоверна (р < 0,05).

Несмотря на определенное антигенное сходство Н. influenzae с пневмококками 6-го типа, другими бактериями рода Haemophilus, конъюгат не выявлял их антигены в концентрации в 100 раз превышающий уровень Н.influenzae-антигенов. При концентрации бактерий менее 2х106 КОЕ/мл разница оптической плотности в пробах, содержащих антигены «b» и других сероваров (в большей степени серовара «с») незначительна, поэтому в концентрациях 104-105 КОЕ/мл, отличие серовара «b» от серовара «с» затруднено. Результаты реакции по определению Н. influenzae, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о затруднении в дифференциации серовара «b» от других сероваров Н. infiuenzae. В то же время результаты реакции с другими видами гемофильных микроорганизмов (Н.parainfluenzae, Н.haemolyticus) не превышают отрицательный контроль. На основании этих исследований можно считать предложенный вариант диагностической тест-системы видоспецифическим, позволяющим определить антигены Н. infiuenzae «а», «b», «c», «d», «e», «f».

Таким образом, показана возможность использования разработанной диагностической тест-системы для обнаружения антигенов в чистых и смешанных культурах, а также в ликворе.

Рис.3. Специфичность «сэндвич» варианта ИФА для определения капсульного полисахарида «b»в сравнении с другими серовариантами. По оси абсцисс - концентрация бактерий в КОЕ/мл (*104), по оси ординат - оптическая плотность при 450 нм.1 - Н.influenzae «b»; 2 - Н. influenzae «c»; 3 – Н. influenzae «f»; 4 - Н.influenzae «e»; 5 - Н.influenzae «d»; 6 – Н. parainfluenzae; 7 - Н. haemolyticus; 8 - Н. рarahaemolyticus.

Разработанный вариант тест-системы по индикации антигенов в ИФА следует считать видоспецифическим, позволяющим обнаружить антигены сероваров Н.influenzae. При этом чувствительность составила 10-45 нг/мл по обнаружению антигена и свыше 7х104-105 КОЕ/мл при хорошей специфичности, воспроизводимости и достоверности исследований.

Предложенные тест-система ИФА, диагностические агглютинирующие капсульные сыворотки, питательные среды (ЭрДС) и способы их приготовления для культурального исследования ликвора и крови, позволили установить этиологический диагноз, определить серовар и биовар при первично-локализованных и инвазивных инфекциях, вызванных Н.influenzae, в том числе у детей с гнойным менингитом, при септической пневмонии, фульминантном сепсисе, остеомиелите. В таб.1 представлены результаты микробиологического исследования крови и ликвора при первичных гнойных менингитах, вызванных Н.influenzae, проведенных различными методами в 1986-2005г.г. Диагноз гнойного менингита, вызванного Н.influenzae, удалось установить с помощью разработанных методов (ИФА, среда ЭрДС) у 32 больных и только у 9 - с помощью и других методов. Как показано в таб.1, у 5 больных микробиологический диагноз был подтверждён при использовании рекомендуемых культуральных методов и у 4 – при индикации антигена методом латекс-агглютинации с использованием коммерческих диагностикумов.

Таблица 1

Микробиологическая диагностика H. influenzae- менингита различными методами

???????????$?e????

???????????

????????? ???????$????

????????????

??????????? ???????? ?????$??

???????????

???????