Delist.ru

Микробиологические аспекты инфекций, вызванных Haemophilus influenzae, у детей (10.09.2007)

Автор: ХОРОШИЛОВ Сергей Евгеньевич

Научная новизна

Впервые разработаны способ и питательная среда для выделения H.influenzae со слизистой носоглотки (патент № 2186389 от 27 июля 2002 г., патент №21936000 от 27 ноября 2002 г.), двухфазная среда ЭрДС – для выделения из стерильных полостей, ЭрДС-агар – для выделения из нестерильных локусов (заявка № 2006139958 от 18.10.2006г.)

Определены методические критерии оценки тест-штамма для бактериологического контроля качества питательных сред, предназначенных для выделения H.influenzae из клинического материала.

Сконструированы отечественные тест–системы ИФА для выявления антигенов H.influenzae серовара «b».

Определена частота инфекций и назофарингеальной колонизации, вызываемых сероварами «a», «b», «c», «d», «e», «f» и биоварами I–VIII H.influenzae.

Осуществлено серологическое и биологическое типирование выделенных со слизистой носоглотки штаммов H.influenzae, вызывающих инвазивные и первично-локализованные инфекции.

Определена частота инвазивных и первично-локализованных форм инфекций, вызванных различными фенотипами H.influenzae, у детей Среднего Урала.

Проведено многоцентровое проспективное исследование назофарингеального носительства H.influenzae у больных и здоровых детей в детских коллективах.

Определена резистентность штаммов H.influenzae, выделенных в Свердловской области, к разным классам антимикробных препаратов.

Практическая значимость работы заключается в получении данных, расширяющих представление о роли H.influenzae, не только серовара «b», но и других сероваров и биоваров при гнойно-септических инфекциях у детей. Полученные диагностические препараты позволяют выявить среди капсульных изолятов серовары, которые могут вызывать различные формы инфекций. Разработанные способы приготовления и контроля качества питательных сред с использованием доступных ингредиентов позволяют выделять H.influenzae из клинического материала в лабораториях любого уровня. Разработанные латексные препараты для сероидентификации H.influenzae позволяют определить серовариант у капсульных штаммов. Предложенная схема исследования материала из стерильных полостей позволяет быстро и качественно выявить возбудитель. Определение биовара позволяет выявить потенциально патогенные биовары среди штаммов H.influenzae.

Полученные данные о резистентности H.influenzae к антибактерильным препаратам позволяют назначать рациональную этиотропную антибактериальную терапию. Практическая значимость работы подтверждена использованием её материалов в образовательных программах на теоретических, практических занятиях и семинарах профессиональной переподготовки при последипломном обучении врачей. Результаты определения резистентности штаммов H.influenzae включены в российский реестр резистентности возбудителей инфекций к антимикробным препаратам.

Внедрение результатов работы. По теме работы получено 2 патента на изобретения – «Транспортная среда для выделения Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 21936000 от 27.11.2002 г.) и «Способ культивирования Haemophilus influenzae из носоглоточной слизи» (патент № 2186389 от 27.06.2002 г.). Подана заявка на изобретение «Питательная среда для выделения H.influenzae и способ её приготовления» - №2006139958 от 18.10.2006 г. Подготовлены методические рекомендации – «Лабораторные методы выделения, идентификации Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 1999), «Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Смоленск, 2003). «Внебольничная пневмония у детей, пособие для врачей-педиатров» (Екатеринбург, 2004), «Лабораторные методы выделения, идентификации, определения чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae» (Екатеринбург, 2006).

Результаты исследований внедрены в лабораториях клинической микробиологии лечебно-профилактических учреждений Министерства здравоохранения Свердловской области, используются в учебном процессе курсов профессиональной переподготовки и тематического усовершенствования для врачей- бактериологов факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Уральской государственной медицинской академии, в исследовательской работе лабораторного отдела Уральского НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии, Уральского НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург).

Полученные диагностические препараты применены в лаборатории менингококковой инфекции и гнойных менингитов Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ, выделенные штаммы представлены для исследования по программе «Пегас I и II» для составления реестра резистентности штаммов Н.influenzae к антибиотикам в России.

Апробация работы

Материалы работы доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпидемиологии, клиники, диагностики и профилактики инфекции, вызываемой Н.influenzae типа «b» (Москва, 1998), на научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины» (Москва, 1999), на Всероссийской научно-практической конференции «Перинатальная анестезиология и интенсивная терапия матери, плода и новорожденного» (Екатеринбург, 1999), на 9 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Берлин, Германия,1999), на научно-практической конференции Западно-Уральского региона «Вакцинопрофилактика в ХХI веке» (Пермь, 2000), на Юбилейной научно-практической конференции «Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях» (Екатеринбург, 2000), на II международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века» (Москва, 2000), на международной научно-практической конференции «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем», посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» (Махачкала, 2003), на V международной конференции по антимикробной химиотерапии (Москва, 2003), на IV межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы обеспечения санитарно- эпидемиологического благополучия населения» (Омск, 2003г), на III Уральской конференции «Болезни органов дыхания» (Екатеринбург, 2003г), на Юбилейной конференции, посвященной 80-летию кафедры микробиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Современная микробиология – клинической медицине и эпидемиологии» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -ХХI век» (Саратов, 2004), на первой Российской конференции «Актуальные проблемы менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» (Москва, 2004), на заседаниях Свердловского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова (Екатеринбург, 2006) , на VIII международной конференции по антибактериальной химиотерапии (Москва, 2006), на межкафедральном совещании в Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации

По результатам исследований опубликовано 96 печатных работ, из них 16 – в журналах, одобренных ВАК.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Указатель литературы включает 141 источник на русском языке и 471 на иностранных языках. В текст включены 22 таблицы и 62 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использовали следующие штаммы микроорганизмов: типовой штамм H.influenzae NCTC № 8143, штаммы H.influenzae: серовара «а» № 1511375/63 IHE, серовара «b» № 151138 11/64 IHE, «b» № 151149 ГИСК, 2«b» 94505/81 HNCВ, серовара «с» № 151140 7/63 IHE, серовара «d» № 151161 27/68, серовара «е» № 151146 9/64 IHE; серовара «f» 10/63 IHE № 151134; АТСС № 49247, АТСС № 49766, H.parainfluenzae № 151135 NCTC 7857, H.haemolyticus NCTC10659 № 151134, H.parahaemolyticus АТСС 10014, Е.coli АТСС 11775, S.pneumoniae АТСС 49619, N.meningitidis АТСС 13077, полученные из музея патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, S.aureus АТСС 12598. авторские H.influenzae серовара «b» - № 98 и № 99.

Методы исследований

Иммунизацию кроликов с целью получения типоспецифических сывороток к капсульным антигенам проводили формолвакцинами штаммов H.influenzae «a», «b», «c», «d», «e», «f» по модифицированной нами схеме Н.И. Храмовой (Храмова Н.И., 1975). Титр и специфичность капсульных сывороток определяли в агглютинационных и преципитационных тестах до и после истощения, а затем использовали при конструирования тест-системы ИФА и диагностикумов для реакции агглютинации латекса и ко-агглютинации.

Для определения оптимального состава и способа приготовления питательных сред использовали основы разного состава - экстракт пекарских дрожжей, кровь кролика и эритроцитарную массу из крови человека, сыворотку крови крупного рогатого скота. Определение чувствительности плотных и полужидких сред по скорости роста и биологическим свойствам культур проводили в соответствии с методическими указаниями (Андреева З.М. с соавт., 1980; Исаева З.А. с соавт., 1980). Исследование параметров роста культур проводили с измерением оптической плотности на этапах культивирования с использованием ФЭК – 56М. Качество питательных сред оценивали, проводя сравнение показателей роста для жидкой среды - по максимальной удельной скорости, экспоненциальной и лаг-фазам, для плотной – по количеству КОЕ и морфологической полноценности культуры.

Твердофазный иммуноферментный анализ для обнаружения антигена H.influenzae «b» в биосубстратах проводили в непрямом «сэндвич»-варианте. Использовали 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола производства фирмы «Dynatech» (Щвейцария) и фирмы «Медполимер» (Россия), лунки которых покрывали глобулиновой фракцией, выделенной из кроличьих гипериммунных сывороток против H.influenzae «b». О результатах специфичного связывания антигенов антителами, фиксированными на полистироле, судили по добавлению специфического конъюгата (антитела против H.influenzae «b», меченные пероксидазой). При определении оптимальных параметров проведения ИФА изучали влияние температурных, экспозиционных факторов, состава и величины промывочного и разводящего буферов, различных концентраций сорбируемых антител.

Для выявления специфического комплекса антиген-антитело использовались пероксидазные конъюгаты на основе антител к полирибозилфосфату H.influenzae. В качестве субстрат-индикаторной смеси использовали ортофенилендиамин с пероксидом водорода. Учет реакции проводили после добавления 0,1М H2S04, оптическую плотность окрашенного продукта ферментативной реакции определяли на вертикальном фотометре Dynatech-4000 (Швейцария) при длине волны 450 нм. Конъюгаты получали на основе общеглобулиновой фракции, выделенной с помощью полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000, «Serva») из кроличьей сыворотки к H.influenzae «b» при помощи перйодатного окисления в отделе новых технологий НИИ ЭМ им. Пастера по методу M.Wilson, Р.Nakone в модификации В.Н. Вербова (1988).

Реакция ко-агглютинации. Культуру S.aureus (штамм Cowan I), выращенную в стандартных условиях, формалинизировали 0,5% раствором 2 часа, трёхкратно отмывали в фосфатно-буферном растворе pH 7,2. Из осадка готовили 40% взвесь, к 1,0 мл взвеси стафилококкового иммуносорбента добавляли 2,5 мл кроличьей сыворотки одного из сероваров H.influenzae, предварительно проверив в реакции агглютинации на отсутствие гетерологичных антител в разведении 1:25. Затем перемешивали при +4?С; отмывали забуференным физиологическим раствором дважды, центрифугируя при 1000 об/мин 10 мин. Осадок разводили буфером, получая 1-2% взвесь, проверяли отсутствие спонтанной агглютинации.

Реакция сопровождалась контролями: несенсибилизированный стафилококковый реагент и отдельно – испытуемый материал (культура H.influenzae) с физиологическим раствором; испытуемый материал и несенсибилизированный реагент; сенсибилизированный стафилококковый реагент и физиологический раствор. Использование реакции ко-агглютинации показало оптимальным использование забуференного физиологического раствора pH 7,2 для проведения реакции в равных объёмах (0,02 мл), учёт через 1 мин после лёгкого нагрева и определение не столько размеров агглютинатов, сколько степени просветления.

Реакция латекс-агглютинации. Для получения иммуноглобулиновых фракций из гипериммунных кроличьих сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e», апробированных в качестве сенситинов, использовали 0,0156 М фосфатный буфер (pH 7,4). К сывороткам добавляли равный объём 20% полиэтиленгликоля, выдерживали при +4?С 10 мин, после центрифугирования при 5000 об/мин в течении 15-20 мин, осадок растворяли до первоначального объёма сыворотки и вновь центрифугировали при указанных параметрах. Надосадочную жидкость растворяли в меньшем количестве забуференного физиологического раствора, проводили диализ в мешке для диализа против забуференного физиологического раствора 24 ч на холоду, затем очищали на колонке с сефадексом G-25, G-200.

Полученный препарат лиофильно высушивали и определяли белок по методу Лоури. Полученные и лиофильно высушенные препараты из сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e» содержали в 1 мг от 389-738 ? белка (по Лоури). Частицы латекса сенсибилизировали по методике Severin (1972). Предварительно определяли специфичность полученных иммуноглобулинов в реакции агглютинации с капсульными вариантами 2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл H.influenzae в концентрации 5х109 КОЕ/мл. Реакцию проводили в термостате при 37? С 2,5 часа во влажной камере.

Латексные препараты получали путём нагрузки 7% полистирольного латекса модифицированного метакриловой кислотой. Латекс получен из института синтетического каучука (Санкт-Петербург). К 3% взвеси латекса добавляли иммуноглобулины, разведенные по белку: (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл), предварительно растворив из сухого лиофильно высушенного препарата. Для определения параметров, необходимых для получения препарата, использовали фосфатный буфер (pH 7,2), глицериновый буфер (pH 8,2), бычий сывороточный альбумин, азид натрия. Нагрузку латекса осуществляли при +37? С 2 ч при постоянном помешивании, остужали при комнатной температуре без доступа света, затем – в холодильнике при +4?С. Отмывание производили при центрифугировании при 8000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли холодный глицериновый буфер (pH 8,2) с бычьим сывороточным альбумином, инозит натрия и встряхивали, отмывая затем 3 раза. Полученные латексные препараты для определения антигенов «a», «b», «c», «d», «f», «e» испытывали с живыми и формалинизированными культурами при разных разведениях с латексными препаратами с разной степенью нагрузки (2мг/мл, 1мг/мл, 0,5мг/мл, 0,25мг/мл, 0,125мг/мл).

Контролями служили забуференный физиологический раствор и частицы латекса без белковой нагрузки. Оптимальными концентрациями иммуноглобулинов при сенсибилизации латекса явилась нагрузка для иммуноглобулиновых препаратов H. influenzae: «a» - 2,0 мкг/мл; H. influenzae «b»- 0,5 мкг/мл, H. influenzae «c» -1 мкг/мл, H. influenzae «d» -1 мкг/мл, H. influenzae «f»-1 мкг/мл, H. influenzae «e»-1 мкг/мл. Чувствительность латексных препаратов (ЛП) определяли с гретыми культурами H.influenzae «a», «b», «c», «d», «f», «e» в концентрации: 5х109, 5х108, 5·х107, 5х·106, 5х105, 5х104, 5х103, 5х102 КОЕ. Чувствительность при выделении H.influenzae «b» ПРФ составила 12,5 нг/мл, при типировании культур в реакции латекс-агглютинации составила 5*105 КОЕ/мл. Специфичность определяли в реакции латекс-агглютинации культур разных сероваров и нетипируемых штаммов H. influenzae .

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ). Для разработки диагностических препаратов для типирования капсульных штаммов типоспецифическими сыворотками к капсульным антигенам использовали инокуляты штаммов H.influenzae всех сероваров в концентрации: 5·109, 5·108, 5·107, 5·106, 5·105, 5·104, 5·103, 5·102 КОЕ. Из них готовили препараты на тонких стеклах из нефлюоресцирующего стекла (фирма «Ниармедик Плюс», Москва). Для удаления группоспецифических антител из каждой из исследуемых кроличьих сывороток применялся сорбент на основе ультраозвученной взвеси H. influenzae других сероваров. На стекла с антигенами H.influenzae наносили разведённые сыворотки, инкубировали во влажной камере при +200С 10 мин. Для выявления комплексов антиген-антитело использовалась антивидовая люминесцирующая сыворотка производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. При микроскопии в люминесцентном микроскопе «Люмам-8» (ЛОМО) оптимальным считали то разведение сыворотки, при котором наблюдалось достаточно интенсивное свечение антигена при постановке реакции с положительными образцами и не наблюдалось – с отрицательными.

Материалы исследований. Обследованы материалы от 1593 больных с подозрением на менингит и 1446 – с другими гнойно-септическими инфекциями, 207 - новорожденных, 253 - с ХНЗЛ; 105 - с острой пневмонией, 399 - с инфекциями Лор-органов; 1061 человек из детских учреждений и 181-здоровых. Проведено микробиологическое исследование следующих клинических биосубстратов: образцы крови – 1892; СМЖ – 1835; раневое отделяемое, пунктаты из ран - 94; пунктаты из плевральной полости – 132; мокрота при острой пневмонии -104, жидкость бронхоальвеолярного лаважа – 452, мокрота при хронических заболеваниях легких - 676, заднеглоточные мазки – 1230, носоглоточные мазки - 56; с конъюнктивы - 340, из половых органов – 96; пунктаты при Лор - инфекциях – 536; сыворотка крови – 1421.

Для определения этиологии инфекций использовали: посевы на кровяной агар на основе Blood agar base, сывороточный агар, желточно-солевой агар (ЖСА), «шоколадный» агар, в соответствии с действующими приказами МЗ (№ 535 от 22.04.85, № 858 от 01.12.88, № 375 от 23.12.98, МУК 4.2.1887-04), и на разработанные автором среды : H. influenzae ЭрДС, H.influenzae ЭрДС-агар с ристомицином, двухфазную среду H.influenzae-ЭрДС. Идентификацию проводили при использовании следующих тест-систем – Api NH, ID Haemo, ID Strep., ID G-; IDC, IDStaph на «ATB Expression»; индикацию антигенов - в «Slidex meningite Kit 5», «Directigen Meningitis combo Test»; МФА M. pneumoniaе, вирусы гриппа А, В, парагриппа, аденовирусы, РС-вирус (НИИ гриппа, НИИМЭ им. Пастера); антитела к M. pneumoniaе определяли в ИФА: SeroMP IgM, SeroMP IgG, МРА Serodia Myco-2; в МФА определяли антитела к C.pneumoniaе C.psittaci, C.trachomatis (IgM, IgA, IgG) (Vircell S.L); в ИФА: SeroСP IgM, SeroMP IgG (Savyon), IgM, IgG, PCHPN, Рneumo (Vircell S.L.). Антитела к S.pneumoniae определяли в ИФА IgG S.pneumoniae, к белкам наружной мембраны и соматическим антигенам H.influenzae в ИФА IgG HIВ, к полирибозилфосфату в ИФА IgG HIB (НИИВС им. И.И. Мечникова), к вирусу гриппа - в РТГА (НИИ гриппа), к L.pneumophila - в МФА Рneumo (Vircell S.L.).

У культур H.influenzae, выделенных из различных локусов, определяли биовар по выделению индола, наличию ферментов орнитиндекарбоксилазы и уреазы; серовар определяли в РА, латекс-агглютинации и РНИФ препаратами, приготовленными нами из полученных кроличьих типоспецифических капсульных сывороток к сероварам «a», «b», «c», «d», «f», «e». Резистентность к антибиотикам АТВNH, АТВHaem на «ATB Expression» (bioMeriuex), дискодиффузионным методом на Haemophilus Test Medium (НТМ)-агаре и методом микроразведений, ?-лактамазы определяли в тесте с нитроцефином и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Контроль качества питательных сред для определения чувствительности к антибиотикам проводили штаммами H.influenzae.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общеупотребительных методов параметрической и непараметрической статистики. КОЕ рассчитывали, исходя из распределения Пуассона. Для оценки частоты различий между показателями, в случаях соответствия вариабельности изучаемых показателей закону нормального распределения, применялся t-критерий Стъюдента. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

загрузка...