Delist.ru

HLA (класс II) и естественный отбор. (10.09.2007)

Автор: Болдырева Маргарита Николаевна

На основании собственных данных и данных литературы предложена новая концепция «функционального» генотипа и гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности.

Научно-практическая значимость. Данные о частотном распределении гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 20 популяционных групп России и стран, граничащих с Россией, имеют самостоятельное популяционно-генетическое значение и могут быть использованы как база данных для региональных, федеральных и международных антропологических исследований, также в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.

Данные о частотном распределении гена DRB1 среди жителей г.Москвы, Удмуртии, принадлежащих к русской популяции, могут быть использованы в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.

Данные о степени генетического родства между популяциями, можно использовать для оптимизации банка неродственных доноров-добровольцев гемопоэтических стволовых клеток по количественному и популяционному составу.

Новый подход к оценке генетической предрасположенности развития аутоиммунных заболеваний на основании оценки DRB1 генотипа можно использовать для дифференциальной диагностики и генетического прогнозирования в семьях больных аутоиммунными заболеваниями.

Сформулированная концепция «функционального» генотипа и гипотеза «функциональной» гетерозиготности могут служить вкладом в теорию иммуногенетики и иммунологии.

Публикации по теме диссертации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 73 печатных работы, в том числе 22 статьи в центральных российских журналах, 40 публикаций в иностранных журналах. Результаты исследования были представлены на 7 Европейских конференциях по гистосовместимости (Будапешт 1997; Страсбург 1998; Крит 1999; Монпелье 2000, Гранада 2001, Страсбург 2002, Баден-Баден 2003), конгрессах РААКИ в 2001, 2002, 2007 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов и 6 глав результатов собственных исследований с анализом литературных данных и выводов. Работа содержит 29 таблиц и 11 рисунков. Билиография состоит из 40 отечественных и 485 зарубежных источников.

Материалы и методы исследования

В ходе работы были обследованы 2525 здоровых (не имеющих тяжелых хронических заболеваний и жалоб на момент обследования), взрослых, не связанных кровным родством представители двадцати этно-территориальных групп, проживающих в различных регионах России, Украины, Белоруссии и Казахстана. Исследования проводились сотрудниками отдела иммуногенетики в период 1994 -2004 годов.

Биологический материал, который использовался для выполнения исследования, был получен из разных источников. Биоматериал от русских из Смоленской области (n=156), белорусов из Витебской (n=70), Брестской (n=105), Гомельской (n=100) областей, украинцев из Хмельницкой (n=138) и Львовской (102) областей, марийцев (202) из республики Марий Эл, гагаузов (n=225) из республики Молдова, полученный в результате этнографических и медико-генетических экспедиций, предоставила лаборатория генетической эпидемиологии (Балановская Е.В.); биоматериал, от большеземельских ненцев (n=92 - Ненецкий Автономный Округ), кольских саамов (n=107, п.Ловозеро, Мурманская область), русских из Архангельской области (n=81), полученный в ходе медико-генетических экспедиций, предоставлен кафедрой медицинской генетики (Евсеева И.В.) Архангельской государственной медакадемии, биоматериал от удмуртов (n=202), собранный в различных районах республики Удмуртия предоставил Ижевский государственный медуниверситет (Поздеева О.С., Ганичева Л.Л.); биоматериал от русских из Костромской области (n=126) предоставлен Костромской областной больницей (Целинская И.Н.); биоматериал от русских из Вологодской области (n=121) предоставлен Вологодской областной больницей (Кашинин М.Н.); биоматериал от татар (потомков переселенных в годы отечественной войны из Казани, n=87) был собран в Кировской области Кировским Институтом переливания крови (Зайцева Л.Н.); биоматериал от тувинцев (n=164) из разных районов республика Тыва предоставлен Институтом медицинских проблем Севера СО РАМН (Осокина И.В.).

Сотрудниками Института иммунологии ФМБА России был собран биоматериал от казахов (Актюбинская область республики Казахстан, n=141), бурят (Гусино-Озерского района Бурятии, n=87), калмыков (из разных районов республики Калмыкия, n=136) и армян (республика Армения, n=83).

В рамках исследований по направлению «HLA и репродукция» были обследованы 240 супружеских пар с повторными прерываниями беременности и неудачными ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение), проходившими обследование в Центре иммунологии репродукции (98 пар) и лаборатории клинической цитогенетики Медико-генетического научного центра РАМН (142 пары). Контролем служили 74 пары, имеющие детей, обратившиеся в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу установления отцовства, которое было подтверждено, и 300 здоровых доноров крови (97 женщин и 203 мужчин) из г. Москвы.

Совместно с сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН были обследованы 11 популяционных групп больных сахарным диабетом 1 типа и соответствующие им контрольные группы, представлявшие собой случайным образом отобранных, здоровых на момент исследования, лиц различной расовой принадлежности: к европеоидам относятся русские из г.Москвы (79 больных СД1/ 300 контроль), русские из Архангельской области (48/81), русские из Вологодской области (69/121), русские из Удмуртии (54/159), татары (96/87), мари (28/202), удмурты (52/101); монголоидам – тувинцы (15/164), калмыки (13/136) и буряты (25/87) узбеки (69/109) принадлежат к смешанному евро-монголоидному типу.

Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре [Miller S.A. et al., 1988]. HLA генотипирование образцов ДНК проводили методом мультипраймерной ПЦР [Трофимов Д.Ю., 1996]. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" («НПФ ДНК-Технология", Москва).

). Расчет генетических расстояний [Nei M., 1972] на основании генных частот проводили при помощи компьютерной программы «DJgenetic», версия 0.03 (Серегин Ю.А., Балановская Е.В.). Графически результаты кластерного анализа представлены в виде дендрограмм и графиков многомерного шкалирования по двум осям [Дерябин В.Е., 1971], построение которых проводили с помощью компьютерной программы «Статистика» (версия 6.0).

Тестирование на нейтральность отбора по Ewens-Watterson для локуса DRB1 было проведено при помощи компьютерной программы «Арлекин»

Относительный риск (ОР) развития/устойчивости к сахарному диабету 1 типа вычисляли по формуле B.Woolf [Певницкий Л.А., 1998]. Этот показатель означает, во сколько раз чаще встречается заболевание при наличии в генотипе индивидуумов какого-либо варианта HLA генов по сравнению с частотой заболевания у индивидуумов без этого HLA варианта. Значения ОР большие, чем 1, свидетельствуют о том, что конкретный вариант DRB1 гена ассоциирован с развитием заболевания, причем, чем больше величина относительного риска, тем ассоциация более выражена. Значения ОР, меньшие, чем 1, свидетельствуют об ассоциации вариантов HLA генов с устойчивостью к развитию заболевания, причем, чем меньше величина относительного риска, тем ассоциация того или иного варианта гена DRB1 с устойчивостью к развитию заболевания более выражена. Значениия ОР, близкие к 1, свидетельствует об отсутствии ассоциаций.

Статистическую достоверность значений ОР определяли по точному двустороннему критерию Фишера без корректировки на количество аллелей [Певницкий Л.А., 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Полиморфизм HLA II и популяционные исследования

Исследование генетического родства 20 популяций России и стран СНГ на основании полиморфизма гена HLA II DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1. Вычисленные частоты гена DRB1 и трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 были использованы для расчета генетических расстояний между популяциями. Результаты кластерного анализа представлены на рисунках 1, 2, 3, в виде денрограмм и двухмерных графиков многомерного шкалирования. Для определения, что лучше отражает генетическое родство исследованных популяций было проведено сравнение данных, полученных на основании частот одного гена DRB1 (рис 1) и трехлокусных гаплотипов трех генов - DRB1, DQA1 и DQB1 (рис 2).

Рис.1. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена DRB1- для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.

Если на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1, белорусы из Витебской области образуют с белорусами из южных районов республикик единый «белорусский» кластер, тем не менее отличаясь от двух, очень генетически близких друг другу групп белорусов из южных районов республики, то на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 белорусы с севера республики уже примыкают к кластеру, состоящему из украинцев, белорусов из Брестской и Гомельской областей и русских из Смоленской области. Положение украинцев из Хмельницкой и Львовской областей и русских из Смоленской области не различаются на обеих дендрограммах.

Рис.2 Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.

На обеих дендрограммах белорусы из южных областей республики (Гомельской и Брестской областей), а также украинцы из центральной (Хмельницкая область) и западной части (Львовская область) страны оказались попарно близки между собой. Русские из Смоленской области были генетически ближе к украинскому кластеру, чем к белорусскому. В этот же кластер вошли гагаузы и армяне, генетически сильно отличающиеся от славянских популяций. Но, если на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (рис.1) эти две популяционные группы образуют отдельный кластер, то на дендрограмме на основе частот DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов (рис.2) гагаузы и армяне последовательно примыкают к кластеру «славянских» популяций. Следующий кластер образовали популяции, проживающие в северном и северо-западном регионах европейской части России. Однако дендрограммы, построенные на основе частот гена DRB1 (рис.1) и DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов (рис.2) несколько различны. В обоих случаях русские из Костромской и Вологодской областей являются наиболее близкими друг другу популяционными группами. Однако, если на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (рис.1) этим двум группам русских наиболее близкими яляются русские из Архангельской области, а затем уже марийцы, то на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 (рис.2) наоборот, генетически более близкими русским из Костромской и Вологодской областей являются марийцы, а затем уже русские из Архангельской области. Еще одно отличие двух дендрограмм касается удмуртов и татар, образовавших отдельный кластер. Если на дендрограмме гена DRB1 (рис 1.) этот кластер примыкает к популяциям, северо-западных областей России, то на дендрограмме гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 (рис 2) этот кластер уже примыкает к популяциям с азиатской генетической основой. Однако в обоих случаях кластер удмуртов и татар довольно сильно отличается от большинства популяций, входящих с ними в более крупный кластер. Это может, вероятно, свидетельствовать о том, что удмурты и татары занимают промежуточное положение между европейским и азиатским генофондом. Следует отметить также, что и различия между ними весьма существенны. Ненцы и саамы, наоборот, на дендрограмме гена DRB1(рис 1) примыкают к «азиатскому» кластеру, в то же время сильно от них отличаясь (особенно саамы), в то время как на дендрограмме гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 (рис 2) примыкают к европеоидным популяциям севера, северо-запада восточной Европы, тем не менее также сильно от них отличаясь, что также говорит о наличиии в их генофонде как северо-европейских, так и азиатских генов.

На дендрограмме гена DRB1 все популяции с азиатской генетической основой или имеющие смешанное евро-азиатское происхождение. образовали кластер, в который вошли попарно более близкие друг другу казахи и калмыки, а также буряты и тувинцы. К ним примыкают ненцы, и затем генетически более далекие от этих групп – саамы. На дендрограмме гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 (рис.2) в один кластер также вошли попарно генетически близие казахи и калмыки, и тувинцы и буряты. Но, в отличие от дендрограммы гена DRB1, к указанной группе примыкают не ненцы и саамы, а близкие друг гругу удмурты и татары.

Взаиморасположение исследованных популяций, на двухмерных графиках многомерного шкалирования, построенных на основании частот гена DRB1 (рис.1) и DRB1-DQA1-DQB1 принципиально не отличалось от соответствующих дендрограмм.

Таким образом, взаиморасположение изученных популяций на графиках многомерного шкалирования и дендрограммах, построенных и на основе частот гена DRB1 и DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов в целом соответствовует их этногенезу и географическому взаиморасположению, что подтверждает возможность использования как отдельных генов HLA класса II, в частности наиболее полиморфного гена DRB1, так и гаплотипов нескольких генов, в частности DRB1-DQA1-DQB1, для изучения генетической истории формирования различных народов. Основные генетические различия между исследованными популяциями улавливаются уже при использовании только гена DRB1, хотя исследование DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов, позволяет выявить более тонкие различия между популяционными группами, то есть более предпочтительно для генетического анализа. Такой вывод совпадает с мнением Begovich AB с соавт. [2001], который считает, что гаплотипы генов HLA являются «подразделением» аллелей, что еще более увеличивает полиморфизм HLA.

Исследование генетического родства 20 исследованных популяций и популяций из разных стран мира на основании полиморфизма гена HLA II DRB1. Из доступных литературных источников были выбраны частотные данные популяций, представляющих, насколько это возможно, коренное население различных стран Европы, Азии, Австралии, Новой Зеландии и Америки. Европейское население представлено жителями Норвегии [Капустин С.И.,1998], Оркнейских островов. Уэльса, Северной Ирландии, Англии, Дании, Финляндии, северной Германии, Швеции, Бельгии, Австрии, юго-восточной Франции, Швейцарии, Чехии, Венгрии, Хорватии, Болгарии, Италии, о.Сардиния, Греции [Terasaki P.I.., Gjertson D.W., 1997]. Кроме того, были использованы данные по HLA типированию евреев из Израиля, жителей Японии, Кореи, Южного Китая, Тайваня, Таиланда, а также аборигенов Австралии, маори, коренных жителей Новой Зеландии, индейцев из Аргентины, Бразилии, Мексики, эскимосов Гренландии [Terasaki P.I.., Gjertson D.W., 1997]. Результаты этого анализа в виде графика многомерного шкалирования представлены на рисунке 3. Плотное «ядро», состоящее из большинства взятых в анализ европейских популяций, вытянуто с юга на север. К этому «европейскому ядру» с одной стороны примыкают удмурты, татары и мари – европеоиды с примесью уралоидного компонента, причем у марийцев в большей мере, чем у удмуртов и татар, проявляется присутствие «северо-европейских» генов.

Рис 3. Расположение 20 исследованных популяций России, стран СНГ и ряда стран Евразии, Австралии, Новой Зеландии, Америки в рамках многомерного шкалирования на основе генетических расстояний по частотам гена DRB1. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты, Сар – жители о.Сардиния, Гре – греки, Бол – болгары, Ита – итальянцы, Гаг – гагаузы, Евр – евреи, Нор – норвежцы, Орк – оркнейцы, Уэл – уэльсцы, СИр – североирландцы, Анг – англичане, Фин – финны, Нем – немцы, Дат – датчане, Чех – чехи, Блг – бельгийцы, Авс – австрийцы, Фра – французы, Шве – шведы, Швц – швейцарцы, Вен – венгры, Хор – хорваты, Таил – таиландцы, Тайв – китайцы из Тайваня, ЮКит – китайцы из южного Китая, Кор – корейцы, Япо – японцы, ИнА – индейцы из Аргентины, ИнМ – индейцы из Мексики, ИнБ – индейцы из Бразилии, Эск – эскимосы Гренландии, Авл – аборигены Австралии, Мао – маори из Новой Зеландии.

Из исследованных азиатских популяций России и стран СНГ ближе всего к европейцам оказались казахи и калмыки. Основу генофонда тувинцев и, особенно, бурят составляют гены центральноазиатского происхождения. Особенно удивительно, что саамы, живущие на Кольском полуострове, по составу HLA генов класса II ближе всего оказались к индейцам из Аргентины и бурятам. Положение ненцев на графике многомерного шкалирования с одной стороны свидетельствует о своеобразии указанной популяционной группы, сочетающей «северо-европейские» гены с уралоидными и сильной примесью генов азиатского происхождения, а с другой - о недостаточности сведений об HLA генетическом профиле различных популяционных групп, в том числе и нашей страны. Эти пробелы могут искажать взаиморасположение популяций и не позволяют более определенно судить о происхождении и их генетическом родстве.

Таким образом, взаимоположение популяций на графиках, полученных на основании расчета генетических расстояний генов HLA класса II (гена DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1), адекватно отражают географическое положение и генетические связи различных популяционных групп, в том числе и 20 популяционных групп из России и стран, граничащих с Россией, что совпадает с современными представлениями о том, что полиморфизм генов HLA, в частности генов II класса, предоставляет почти уникальные возможности для исследований в области популяционной геномики [Erlich H.A. et al.,.2006]. Особенно большие возможности предоставляет еще более выраженный, чем аллельный, гаплотипический полиморфизм генов HLA, который позволяет определять более тонкие различия между популяциями, что также совпадает с представлениями сегодняшнего дня [Begovich A.B. et al., 2001].

Есть ли селекция гена DRB1 в обследованных группах? Данные теста на нейтральность отбора [Ewens W.J., 1972; Watterson G.A., 1978] свидетельствуют о том, что в подавляющем большинстве исследованных популяций наблюдаемая гомозиготность по специфичностям гена DRB1 существенно ниже, чем ожидаемая, что свидетельствует в пользу балансирующей селекции по гену DRB1 и совпадает с большим количеством исследований [Klitz W; et al.,1986; Salamon H, et al., 1999; Tiercy J.M. et al., 1992; Mack S.J. et al., 2000 Tsai Y. et al.,2006 Luo M. et al.,2006]. Только у саамов и татар значения ожидаемой и наблюдаемой гомозиготности достоверно не различались, что говорит скорее о нейтральности отбора в отношении указанных групп. Подобные результаты также получены исследователями относительно разных популяций [Tsai Y. et al.,2006 Luo M. et al,2006].

Заключение. На основании проведенного анализа данных типирования исследованных популяционных групп по генам HLA класса II можно заключить что ген DRB1, и, особенно, трехлокусные гаплотипы DRB1-DQA1-DQB1 адекватно отражают этногеографическое соотношение исследованных популяций и поэтому пригодны для использования их в качестве инструмента популяционной генетики и географии для изучения генетического родства популяций. Кроме того, практически все исследованные популяционные группы находятся под влиянием балансирующей селекции, которая приводит к снижению количества гомозигот, в частности по гену DRB1 и, соответственно по всем сцепленным с ним генам II класса HLA.

Механизмы селекции могут осуществляться через функцию генов HLA, как генов иммунного ответа. Проверка этой гипотезы предстоит в последующих разделах.

2. Естественный отбор и HLA II

Выше были представлены данные, подтверждающие возможность использования полиморфных генов HLA класса II для исследования генетического родства различных популяций. С другой стороны гены HLA класса II – это гены иммунного ответа, непосредственно участвующие в его развитии, прежде всего на инфекционные агенты. Известно также, что гены II класса имеют выраженную ассоциацию с развитием аутоиммунных заболеваний и имеют отношение к развитию ряда патологий, приводящих к нарушению репродукции. Эти факты говорят о том, что гены HLA II класса должны непосредственно подвергаться действию естественного отбора

Инфекции. Открытие Цинкернагелем и Догерти [Zinkernagel R.M. and Doherty P.C., 1974] иммунного распознавания вирусных антигенов Т-лимфоцитами «в контексте» белков главного комплекса тканевой совместимости хозяина, за которое они получили Нобелевскую премию, позволило им предположить, что генетические различия индивидуумов в локусе, кодирующем MHC белки, могут влиять на интенсивность и эффективность ответа хозяина на инфекцию [Lipsitch M. et al, 2003], определяя, тем самым, результат этого взаимодействия. Таким образом, гены HLA II класса, являясь генами иммунного ответа, представляющими чужеродные пептиды клеткам иммунной системы должны находиться под давлением естественного отбора. Усилия многих лабораторий были направлены в сторону изучения возможных точек приложения естественного отбора, касающегося действия инфекционного окружения.

В ряде исследований содержатся результаты об ассоциациях генов HLA с исходом разных инфекций противоречащие друг другу [Lockett S.F., et al., 2001; Ng M.N. et al., 2004; Roe D.L. et al., 2000; Thursz M. et al., 1999]. Это свидетельствует как о сложности предмета исследований, так и недостаточности наших знаний о процессах, которые могут происходить в результате действия инфекционных агентов. В таблице 1 приведены данные о вариантах гена DRB1, ассоциированных с развитием и устойчивостью (или самостоятельным клиренсом) к некоторым инфекциям. Подобные данные есть и в отношении ассоциации вариантов гена DRB1 с эффективным и неэффективным ответом на вакцинацию [Hayney M.S., 1996, Caillat-Zucman S., 1998, Hopkins W.J., 1999, Nardin E.H., 2000, Vidan-Jeras B., 2000, Poland G.A., 2001, Qian Y., 2002, Thio C.L., 2003, Wang C. et al , 2004].

загрузка...