Изучить роль дефицита магния в формировании судорожной готовности и провести сравнительную оценку влияния солей магния на индуцированную судорожную активность.

Оценить влияние дефицита магния на липопротеиновый профиль плазмы крови и обосновать использование солей магния в коррекции дислипидемии.

Исследовать дефицит магния как фактора литогенности мочи и обосновать использование солей магния в коррекции различных форм уролитиаза.

Изучить характер иммуно-воспалительных процессов и порог болевой чувствительности в патогенезе дефицита магния, а так же провести сравнительную оценку антиноцицептивной активности и противовоспалительного действия некоторых органических и неорганических солей магния у животных на фоне системного алиментарного дефицита магния.

Исследовать влияние дефицита магния на гемореологические параметры животных и исследовать эффективность некоторых органических и неорганических солей магния в терапии гемореологических нарушений при пероральном введении в условиях алиментарной гипомагнезиемии.

Оценить влияние дефицита магния на аритмогенный порог миокарда и обосновать использование солей магния в коррекции нарушения ритма при профилактическом пероральном введении.

Изучить роль дефицита магния в регуляции гомеостаза калия и обосновать использование калий-магниевых солей в коррекции осложнений дефицита магния и магнийзависимого дефицита калия.

Определить острую токсичность наиболее фармакологически активных органических и неорганических солей магния.

Научная новизна исследования. Впервые проведено сравнительное изучение фармакологической активности 11-ти органических (Mg L-, D- и DL-аспарагинат, Mg L- и DL-глутамат, Mg DL-пироглутамат, Mg глицинат, Mg лактат, Mg сукцинат, Mg тауринат, Mg цитрат), 8-ми неорганических (Mg хлорид, Mg нитрат, Mg тиосульфат, Mg трисиликат, Mg гидрофосфат, Mg карбонат, Мg оксид, Mg сульфат) солей магния и 4-х коммерческих магний-содержащих препаратов (Mg L-аспарагинат в таблетках, магне В6, аспаркам, магнерот) при пероральном введении в условиях алиментарного и лекарственного дефицитов магния. Установлено, что Mg хлорид и Mg L-аспарагинат устраняют дефицит магния быстрее других солей. Впервые показана более высокая биодоступность комплекса магния с L-стереоизомером аспарагиновой кислоты, по сравнению с DL- и D-стереоизомерами и другими изучаемыми солями магния. Установлено, что применение витамина В6 с Mg хлоридом и Mg L-аспарагинатом приводит к увеличению биодоступности данных солей, а по скорости компенсации дефицита магния данные комбинации превосходят препарат сравнения магне В6 (Mg лактат с витамином В6). Впервые проведено изучение фармакологических свойств Mg хлорида и Mg L-аспарагината, а так же их комбинаций с витамином В6 в условиях патологии. Установлено, что Mg хлорид и Mg L-аспарагинат и их комбинации с витамином В6 при пероральном применении устраняют иммуно-воспалительную реакцию и восстанавливают порог болевой чувствительности, оказывают гиполипидемический и антиаритмический эффекты, благоприятно влияют на течение кальцийоксалатного уролитиаза, а также способствуют нормализации гемореологического статуса у животных с дефицитом магния. Показано, что изучаемые комбинации солей магния с пиридоксином обладают наибольшей антидепрессантоподобной, анксиолитической и противосудорожной активностью, по сравнению с некомбинированными солями. Обнаружено, что соли магния способствуют стабилизации/модуляции активности серотонинергических и м-холинергических структур, ослабляют адренергические влияния в ЦНС в условиях алиментарного дефицита магния. Установлено, что Mg хлорид, Mg L-аспарагинат и их комбинации с витамином В6 являются малотоксичными и безопасными. Изучено влияние калий магниевых солей L-, D- и DL-аспарагиновой кислоты на последствия нарушения гомеостаза калия и магния в условиях дефицита магния и лекарственной (фуросемидной, дигоксиновой) интоксикации. Впервые проведено сравнительное изучение фармакологической и токсикологической активности растворов K,Mg L-, D- и DL-аспарагината.

Научно-практическая значимость работы. Показана значительная роль витамина В6 в увеличении биодоступности магниевых солей. Экспериментально доказана эффективность Mg хлорида и Mg L-аспарагината в комбинации с витамином В6 при депрессивных состояниях, судорожных припадках, системном воспалении, дислипидемии, аритмиях, нарушении гемобиологического статуса, формировании уролитиаза в условиях алиментарного дефицита магния. Данные результаты позволяют обосновать перспективность создания на основе комбинаций Mg хлорида и Mg L-аспарагината с витамином В6 лекарственной формы для перорального применения в качестве средств коррекции дефицита магния и ассоциированной с ним патологии.

Реализация результатов исследования. Оригинальные экспериментальные модели формирования уролитиаза в условиях алиментарного дефицита магния и интоксикации этиленгликолем, а также экспериментальные модели формирования депрессивно-подобного поведения, снижения аритмогенного и судорожного порога в условиях алиментарного дефицита магния применяются в НИИ Фармакологии ВолГМУ и лабораторией патологии Волгоградского научного центра РАМН при проведении научных экспериментов. Результаты работы включены в лекционный материал для студентов лечебного, педиатрического, фармацевтического факультетов, слушателей факультета усовершенствования врачей и провизоров на кафедрах фармакологии, общей химии, фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, на кафедрах фармакологии Саратовского и Ростовского государственных медицинских университетов. Создан новый лекарственный препарат для инъекций и инфузий (Аспаркам-L, "Биосинтез", Россия и РУП "Белмедпрепараты", Белоруссия) на основе калий магниевой соли L-аспарагиновой кислоты в качестве средства коррекции дефицита калия и магния.

Основные положения, выносимые на защиту

В зависимости от величины полной компенсации системного алиментарного дефицита магния в эритроцитах исследуемые соли и препараты можно ранжировать в следующем порядке: Mg L-аспарагинат = Mg хлорид > Mg DL-аспарагинат > Mg тауринат > Mg L-аспарагинат (в таблетках) > аспаркам (K,Mg DL-аспарагинат) > Mg DL-глутамат > Mg DL-пироглутамат > Mg глицинат > Mg D-аспарагинат > Mg цитрат > Mg L-глутамат > Mg нитрат > магнерот (Mg оротат) > Mg лактат > Mg тиосульфат > Mg сукцинат > Mg гидрофосфат > Mg оксид > Mg сульфат = Mg карбонат > Mg силикат.

Витамин В6 в комбинациях с Mg L-аспарагинатом и Mg хлоридом увеличивает биодоступность данных солей и, тем самым, повышает скорость компенсации дефицита магния в организме в условиях гипомагнезиемий. При этом комбинации Mg L-аспарагината и Mg хлорида с витамином В6 по величине компенсации дефицита магния не уступают препарату сравнения магне В6 (Mg лактат в комбинации с витамином В6).

Mg хлорид и Mg L-аспарагинат в комбинациях с витамином В6 при пероральном введении устраняют депрессивно-подобное и тревожное поведение, нормализуют процессы адренергической, холинергической и серотониновой нейротрансмиссии в ЦНС, проявляют противосудорожный эффект на фоне компенсации алиментарной гипомагнезиемии.

В условиях компенсации дефицита магния Mg хлорид и Mg L-аспарагинат и их комбинации с витамином В6 при пероральном применении приводят к устранению иммуно-воспалительной реакции и восстанавливают порог болевой чувствительности магнийдефицитных животных, благоприятно влияют на течение кальцийоксалатного уролитиаза.

Mg хлорид и Mg L-аспарагинат и их комбинации с витамином В6 оказали гиполипидемический и антиаритмический эффекты, а также способствовали нормализации гемореологического статуса у животных с дефицитом магния.

Апробация работы. Материалы работы доложены на 55-ой и 58-ой конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров, Пятигорская государственная фармацевтическая академия, г. Пятигорск (2000; 2003); на V Международном симпозиуме “Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровья семьи”, Красноярск (27-29 июня 2001); на Съезде “Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения”, г. Санкт-Петербург (4-6 июля 2002); на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва (8-12 апреля 2002); на Всероссийской научной конференции “Нейрофармакология в XXI веке”, посвященной 110-летию академика АМН СССР С.В.Аничкова, г. Санкт-Петербург (18-20 сентября 2002); на 15-ом Конгрессе Европейского колледжа Нейропсихофармакологии (15th Congress of the European College of Neuropsychopharmacology), Barcelona, Spain (October 5-9, 2002); на Юбилейной научно-практической конференции “Роль курортной науки и практики в охране здоровья населения России”, посвященной 200-летию Кавказским минеральным водам, Государственный научно-исследовательский институт курортологии, г. Пятигорск (2003); на 2-ом и 3-м Съездах Российского Научного Общества фармакологов – “Фундаментальные проблемы фармакологии”, д/о “Подмосковье”, г. Москва (21-25 апреля 2003) и “Фармакология – практическому здравоохранению”, г. Санкт-Петербург (23-27 сентября 2007); на Международной научно-практической конференции, посвященной 200-летию Кавказских Минеральных Вод (“Биоресурсы. Биотехнологии. Инновации Юга России”), г. Пятигорск (21-24 октября 2001); на международном конгрессе “Кардиостим-2004”, г. Санкт-Петербург (5–7 февраля 2004); на 8-ом и 9-ом Международных симпозиумах по биометалам в биологии и медицине (8th International Symposium on Metal Ions in Biology and Medicine, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary, May 18-22, 2004; 9th International Symposia on Metal Ions in Biology and Medicine “Metal ions role in life: an integrated view”, Centro de Congressos da Universidade Catolica, Lisboa, Portugal, May 21-24, 2006); на 1-ом Съезде Российского общества медицинской элементологии (Росмэм), г. Москва (9-10 декабря 2004); на Гордоновской конференции по магнию в биохимических процессах и медицине (Gordon Research Conference on Magnesium in Biochemical Processes & Medicine), Ventura, California, USA (February 6-11, 2005); на 8-ой региональной конференции Европейского колледжа Нейропсихофармакологии (8th ECNP Regional Meeting), Moscow, Russia (April 14-16, 2005); на Первом Всероссийском съезде аритмологов, г. Москва (16-18 июня 2005); на 1-ом Европейском конгрессе по магнию (Ist Annual European Congress & X Jubilee Polish Magnesium Symposium) “Magnesium and other bioelements in organism and in environment”, Krakow, Poland (September 23-24, 2005); 4-ой Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам”, д/о “Подмосковье”, г. Москва (13-16 марта 2006); на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва (3-7 апреля 2006); на 11-ом Международном симпозиуме по магнию (11th International Magnesium Symposium & Joint Meeting of the Japanese Society for Magnesium Research), Shima Kanko Hotel, Kashikojima, Japan (October 23-26, 2006) и на II-ой Международной научно-практической конференции “Биоэлементы” (Научные основы и опыт применения биоэлементов в медицине, спорте, пищевой промышленности и сельском хозяйстве), г. Оренбург (23-25 января 2007). По теме диссертации опубликовано 55 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 рисунками, содержит 36 таблиц и 1 приложение. Состоит из "Введения", "Обзора литературы" (глава I) и 9-ти глав собственных исследований (главы III – XI), обсуждения результатов (глава XII), выводов и списка литературы, включающего 79 отечественных и 611 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы иследования

Материалы. Проведено изучение фармакологической активности 11-ти органических (Mg L-, D- и DL-аспарагинат, Mg L- и DL-глутамат, Mg DL-пироглутамат, Mg глицинат, Mg лактат, Mg сукцинат, Mg тауринат, Mg цитрат), 8-ми неорганических (Mg хлорид, Mg нитрат, Mg тиосульфат, Mg трисиликат, Mg гидрофосфат, Mg карбонат, Мg оксид, Mg сульфат) солей магния и 4-х коммерческих магний-содержащих препаратов (Mg L-аспарагинат в таблетках, Пятигорская государственная фармацевтическая академия; магне В6 фирмы Sanofi-Aventis, Франция; аспаркам фирмы ОАО “Фармак”, Украина; магнерот фирмы Woerwag Pharma, Германия). Наиболее активные органические и неорганические соли магния комбинировали с витамином В6 (пиридоксин производства «F. Hoffman La Roche A.G.», Германия).

Исследования были выполнены на 2653 половозрелых нелинейных белых крысах-самцах массой 170-260 г, 571 белых неимбредных мышах обоего пола массой 22-24 г и 43 морских свинках, массой 550-720 г. Животные содержались в условиях вивария, согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ Р 50258-92, ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе исследований Волгоградского Государственного Медицинского Университета (протокол №35-2006 от 27.03.2006).

Для моделирования алиментарного дефицита магния животные содержались на магнийдефицитной диете «ICN Biomedicals Inc.» (Aurora, Ohio, США), которая включала 20,0% казеина, 70,0 % крахмала, 0,3% DL-метионина, 0,2% холина битартрата, 3,5% диеты составляла полиминеральная смесь AIN-76, не содержащая магний.

Методы исследования. Изучаемые соли и препараты магния вводились перорально через зонд в дозе 50 мг элементарного магния на кг массы тела животного. Соотношение витамина В6 и элементарного магния составляло 1:10. Скорость и степень развития гипомагнезиемии контролировали, определяя содержание магния в плазме и эритроцитах животных, спектрофотометрическим методом по цветной реакции с титановым желтым по Kunkel H.O., Pearson P.B. et al. (Меньшиков В.В., 1987), с дальнейшим расчетом величины компенсации дефицита магния:

Антидепрессантная и транквилизирующая активность солей магния изучалась в условиях тестов «открытое поле» [Bure? Y., Bure?ova O., 1983], «крестообразный лабиринт» (Pellow S., Chopin P., 1985), а также тесте Порсольта [Porsolt R.D., 1977] в модификации Detke M.J. [1996].

Изучение центрального механизма действия магниевых солей, по сравнению с магнийдефицитными животными, проводилось с использованием методик, основанных на взаимодействии с основными нейромедиаторами [Андреева Н.И., 2005]. Влияние на моноаминергические системы мозга изучалось в тестах с фенамином (5 мг/кг, в/б), апоморфином (1,5 мг/кг, в/б), клофелином (0,1 мг/кг, в/б) и 5-гидрокситриптамином (150 мг/кг, в/б); холинергическое действие изучалось по изменению эффектов никотина (6 мг/кг, в/б) и ареколина (15 мг/кг, в/б).

Судорожный порог оценивался согласно методике, описанной Ворониной Т.А., Неробковой Л.Н. [2005]. Методом пробит-анализа устанавливалась TID50 – доза коразола, вызывающаю судороги у 50% животных.

Для оценки тяжести системной воспалительной реакции подсчитывали общее количество лейкоцитов крови и лейкоцитарную формулу [Предтеченский В.В., Боровская В.М., 1950], оценивали выраженность гиперемии ушных раковин [Bussiere F.I. et al., 2002], измеряли массу селезенки и рассчитывали весовой коэффициент селезенки.

Для оценки тяжести фибромиалгии измерение болевого порога проводилось с использованием механического анальгезиметра (тест Randall L.O., Selitto J. [1957]; Шварц Г.Я., Сюбаев Р.Д. [2005]). Величиной болевого порога являлся вес в граммах, при достижении которого проявлялся рефлекс отдергивания лапы. Для оценки состояния центральной ноцицепции использовался метод болевого электрического раздражения корня хвоста биполярными подкожными электродами [Carroll M.N., 1960].

Способность солей магния изменять аритмогенный порог при профилактическом введении изучалась на модели хлоридкальциевой аритмии. Доза кальция хлорида, вызвавшая аритмию у 50% животных (ATD50), была рассчитана с помощью пробит-анализа. Антиаритмическое действие солей магния изучали в соответствии с “методическими указаниями по изучению антиаритмической активности фармакологических веществ” [Каверина Н.В. и др., 2000]. Аритмия с механизмом ранней постдеполяризации моделировалась по общепринятой методике с помощью аконитина (50 мкг/кг), задержанной постдеполяризации – строфантина K (0,5 мг/кг) и хлорида кальция (250 мг/кг). Эффективность препаратов оценивали по их способности предупреждать возникновение аритмии и фибрилляций, удлинять время латентного периода и время выживания животных в эксперименте. На модели аконитиновой аритмии для препаратов были рассчитаны ED50 и антиаритмический индекс (LD50/ED50), отражающий терапевтическую широту препарата.

Для оценки липидного статуса спектрофотометрически измеряли уровень общего холестерина, триглицеридов, ЛПВП в сыворотке крови. Концентрация аполипопротеинов А1 и В оценивалась турбидиметрически. Уровень ЛПНП рассчитывался по формуле Фридвальда, также проводилась оценка индекса атерогенности [Friedewald W.T. et al., 1972; Izawa S. et al., 1997].

Влияние исследуемых солей магния на гемореологический статус оценивалось по следующим показателям: вязкость крови, стандартизированной по гематокриту 45%, и бедной тромбоцитами плазмы [Добровольский Н.А., 1989; Муравьев А.В. и др., 1998], величина гематокрита, количество тромбоцитов крови [Баркаган З.С., Балуда В.П., 1980], вязкость взвеси и индекс агрегации эритроцитов, процессы агрегации тромбоцитов [Born G., 1962; Габбасов З.А. с соавт., 1989], тромбиновое и протромбиновое время, активированное парциальное тромбопластиновое время, а также время образования нитей фибрина [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001].

Экспериментальный уролитиаз моделировали в условиях алиментарной гипомагнезиемии, а также путем добавления в питьевую воду этиленгликоля (0,75% р-р) и аммония хлорида (2% р-р) [Fan J., 1995]. Количество кристаллов оксалата в моче животных подсчитывали при помощи микроскопа «Биолам ЛОМО» (г. Санкт-Петербург). Уровень оксалатов в моче определялся титриметрически по методу Сивориновского Г.А. [1969], неорганических фосфатов – по реакции образования окрашенного комплекса с молибдатом аммония, кальция – с о-крезолфталеином, креатинина по реакции Яффе с использованием стандартных диагностических наборов фирмы «Витал-диагностикум», г. Санкт-Петербург.

Острая токсичность солей магния определялась при пероральном введении [Арзамасцев Е.В. с соавт., 2005].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью параметрических и непараметрических методов анализа [Гланц С., 1998]. Для обработки результатов использовалась программа «Statistica 6.0».

Результаты исследований и их обсуждение

Сравнительная скорость компенсации дефицита магния органическими и неорганическими солями магния

В результате проведенных исследований было показано, что содержание животных на безмагниевой диете сопровождалось изменением внешнего вида и ряда интегральных показателей. Так, в группе животных, получавших диету, наблюдалось потускнение шерстного покрова, гиперемия открытых участков тела (ушных раковин, хвоста и лап), отмечалась гибель животных. При анализе динамики веса животных, получавших диету, не содержащую магний, было показано статистически значимое снижение массы тела. При этом к 7 неделе наблюдалось максимальное снижение веса в среднем с 289,6±18,2 гр. в контрольной группе до 208,5±12,0 гр. в группе магнийдефицитных животных.

У крыс, находящихся на безмагниевой диете, к концу 8 недели наблюдалось достоверное снижение уровня магния в эритроцитах в среднем на 57% (с 2,07±0,02 до 0,89±0,03 мМ/л) и в плазме – в среднем на 47% (с 1,27±0,03 до 0,67±0,03 мМ/л), по отношению к группе интактных крыс.