Delist.ru

Современные биотехнологический процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов (09.01.2008)

Автор: Гринь Светлана Анатольевна

После 4 ч культивирования сальмонелл шт. ТС-177 по ранее действовавшей НТД наблюдалась фаза замедления роста. После подключения мембранного биологического реактора (МБР) концентрация жизнеспособных сальмонелл возрастала еще на протяжении 8 ч. Выращивание культивирования позволяло продлить рост и увеличить накопление жизнеспособных сальмонелл в 3-4 раза.

После этого в МБР поддерживался оптимальный режим культивирования, что позволило еще на 4 ч продлить активную фазу роста и увеличить концентрацию жизнеспособных сальмонелл еще более чем в 7 раз. Коэффициент разбавления питательной средой при этом поддерживался в пределах 0,5-0,7 1/ч.

2.2.6. Современные оборудование и методы очистки и концентрирования питательных сред, антигенов, вирусов и микроорганизмов

Использовались высокоэффективные аппараты для разделения, очистки и концентрирования полидисперсных жидких систем методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования и ультрафильтрования. Использованы новые жидкостные сепараторы и осадительно-фильтрующие центрифуги на бесприводной основе с высокими технико-экономическими показателями. Теоретически и практически подтверждено, что применение фильтрующих перегородок в роторе и осадительно-фильтрующей центрифуги и сепаратора-разделителя позволяет улучшить качество разделения жидких биологических систем.

Очистка и концентрирование на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита

При проведении физико-химических исследований структуры вирусов, создания диагностикумов, получения специфических антисывороток, проведения генно-инженерных работ необходимы очищенные и концентрированные препараты.

С целью определения оптимальных условий очистки и концентрирования культурального вируса бешенства был испытан ряд методов.

Определяли условия осаждения вируса ПЭГ с молекулярной массой 1000, 3000, 6000 и 20000 Дальтон в различных концентрациях: 2,5, 5,0, 7,5 и 10,0.

Для концентрирования вируса применяли метод ультрафильтрации, позволяющий свести к минимуму необходимость использовать дорогостоящее оборудование. Он дает возможность работать с большими объемами вирусного материала. Метод основывается на отделение вируса от культуральной жидкости с помощью полупроницаемых мембран с определенной степенью пористости.

Наиболее широко применяемым способом получения вирусов в чистом виде является центрифугирование дифференциальное, равновесное и в градиенте плотности. При высокоскоростном центрифугировании 90 тыс.g. полное осаждение вируса происходило за 6 часов.

Для концентрирования вируса бешенства использовали равновесное центрифугирование на «подушке» сахарозы(55%), хлористого цезия (22%) и глицерина (80%). Проводили центрифугирование при 161 тыс.g на ультрацентрифуге в течение 4 ч.

На основании полученных результатов была составленна схема получения очищенных и концентрированных препаратов вируса бешенства. По предлагаемой схеме очистки и концентрирования вируса бешенства удается получить высокоочищенный на 99,99% вирус.

Для получения очищенных и концентрированных препаратов вируса ИРТ КРС были испытаны те же принципы выделения вирусов из суспензий.

Результаты получены аналогичные как при выделении вируса бешенства.

2.2.7. Инактивация вируса бешенства

В работе был использован вирус бешенства, штамм «Щелково-51», репрдуцированный в культуре клеток ВНК-21/13. Вирус инактивировали при различной температуре, фенолом и (-пропиолактоном.

Термическая инактивация

Прогревание при +560С оказывало влияние на гемагглютинирующую активность вируса. Через 3 ч после начала обработки титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 (в исходном вирусном материале) до 1:12. К 4-му часу инактивации он снижался в 2 раза (до 1:8) и далее к 5-му часу - до 1:4. На комплементсвязывающую и преципитирующую активности прогревание при температуре 56°С в течение 6-ти часов не оказывало влияния. Биологические свойства вируса, помещенного в условия температуры 62°С, проверяли через 5, 10, 15 и 30 минут и далее через каждые 30 минут до 4 ч инкубации, а затем через 5 и 6 часов с момента начала обработки. Было установлено, что в результате воздействия температуры 62°С инактивация вируса шла быстрее, чем при 56 С. Уже через 45 минут происходила полная потеря инфекционности вируса бешенства. Кроме того, наблюдалось резкое снижение гемагглютинирующей активности препарата. Титр гемагглютинирующей активности снижался с 1:16 в исходном вирусе до 1:4 в прогретом препарате. При дальнейшем прогревании титр гемагглютинирующей активности постепенно снижался и к 210-240 минуте после начала обработки был равен 0. Комплементсвязывающая и преципитирующая активности вируса в течение всего опыта оставались неизменны.

Как видно из приведенных данных, скорость тепловой инактивации препаратов культурального вируса бешенства зависела от температуры.

Химическая инактивация

При изучении влияния фенола на комплементсвязывающую активность вируса бешенства было установлено, что активность вируса в этой реакции, по сравнению с инактивированным вирусом, в течение 72 ч не изменялась при +4°С. С повышением температуры до 20°С через 24ч инкубации наблюдалось снижение титра комплементсвяывающей активности в 2 раза. Через 48 и 72 ч дальнейшего понижения титра не наблюдалось как при +20°, так и при +37°С.

Концентрация фенола и температура инактивации не влияли на титры гемаггрлютинирующий активности вируса бешенства. Титры сохранялись в пределах 1:12-1:16.

Титр преципитирующей активности оказывает влияние увеличение концентрации фенола. Если через 24 ч инкубации при концентрации фенола 0,25% титр не изменялся и был равен исходному 1:28, то при добавлении фенола в концентрации 0,5%-0,75%- 1,0% титр снижался до 1:10, 1:8 и 1:4, соответственно, при всех температурах. Титр преципитирующей активности, снижающийся с 1:28 до 1:4 при обработке 1,0% фенолом в течение 24 ч, далее оставался неизменным. При обработке препаратов вируса всеми концентрациями фенола преципитирущая активность снижалась к 72 ч до 1:12-1:4 при всех температурах.

На основании полученных нами данных были установлены оптимальные режимы инактивации вируса бешенства фенолом: 0,75% концентрация при температуре +20°С в течение 48 ч или при +37°С в течение 24 ч.

Результаты опытов показали, что иммуногенность препаратов, инактивированных 0,75% фенолом при температуре +20°С в течение 48 ч, в 2 раза превышает иммуногенность препаратов, обработанных при +37°С фенолом в такой же концентрации и индекс иммуногенности соответственно равнялись 0,68+0,07 и 0,30+0,10 (n=9).

Полученный препарат гемагглютинина обрабатывали (-пропиолактоном в тех же условиях, что и цельный вирус, учитывая период полураспада пропиолакто-на в водном растворе (при +37°С 24-32 мин, +25°С 210 мин, +4°С от 16 до 20 часов), (-пропиолактон в максимальной концентрации 1:2000 при температуре +37°С в интервале 15-120 минут не влиял на ГА-активность гемагглютинина, которая оставалась на уровне исходной. При инактивации вируса в условиях температуры +4° и +20°С также не наблюдалось потери ГА-активности белкового компонента в течение всего срока наблюдения. Ранее мы установили, что используя (-пропиолактон в концентрации 0.05% (1:2000), можно получить неинфекционные и иммуногенные препараты вируса бешенства.

На основании полученных данных мы предположили, что (-пропиолактон, используемый для инактивации вируса бешенства в макси- мальной концентрации 0.05%, взаимодействует с основаниями РНК, лишая тем самым вирус инфекционности. Были проведены опыты по выяснение взаимодействия (-пропиолактона с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями РНК: аденозином, гуанозином, цитидином и уридином.

Контроль за ходом реакции осуществляли хроматографически и спектрофотометрически (по изменению характера спектра реакционной смеси во времени) при длине волны 200-350 нм. В качестве контрольного спектра использовали спектр немодифицированного аденозина.

Для характеристики продукта реакции (-пропиолактона с аденозином полученное вещество выделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии в системах А, В и С. Вещество характеризовалось хроматографической подвижностью Rf на SiО2.

???????¬??

???????F????#?

!тственный за иммуногенность, (-пропиолактон не оказывает влияния. Он взаимодействует с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями вирусной РНК. Изменения в РНК, вызываемые взаимодействием (-проипиолактона с основаниями, приводит к ее инактивации.

2.2.8. Биологические свойства культурального вируса бешенства

В настоящей работе представлены результаты изучения биологических свойств культурального вируса бешенства, репродуцированного в культуре клеток ВНК-21/13, штамм Щелково-51 вируса: гемагглютинирующие (ГА), комплементсвязывающие (КС), преципитируюшие (Пр) и иммуногенные (Им), а также влияния таких физико-химических факторов, как обработка вируса ферментами РНК-аза, трипсин и рН среды.

Для сохранения биологических свойств вируса бешенства оптимальными являются пределы рН 6,0-8,0. Вирус обладает комплементсвязывающей активностью при рН 6,0-8,0, гемагглютиниру- ющей - при рН 3,0-9,0, преципитирующей - при рН 5,0-9,0.

Препараты вируса обрабатывали трипсином в концентрации 0,05, 0,10 и 0,15% и РНК-азой в концентрации 0,05, 0,02 и 0,01%. Инкубацию проводили 30 минут при +37 С. Затем в обработанных ферментами препаратах вируса определяли титр инфекционности, комплементсвязывающей, гемагглютинирующей и преципитирующей активности.

Трипсин и РНК-аза оказывают влияние на инфекционность вируса бешенства. Трипсин в концентрации 0,05% практически не снижает инфекционность вируса. С повышением концентрации фермента до 0,10% титр инфекционности снижается на 1,75 lg, а при обработке вируса 0,15% трипсином происходит снижение его до 0. РНК-аза существенно снижает инфекционность в пределах более 2 lg (с 6,25 до 4,00 lg) при всех изученных концентрациях.

Оба эти фермента не влияют на его гемагглютинирующую и преципитирующую активность. РНК-аза не снижает также и комплементсвязывающую активность, в то время как трипсин разрушает ее.

2.2.9. Очистка Ig

Иммуноглобулин G из сыворотки крови животных выделяли осаждением 33 % сернокислым аммонием. Полученную глобулиновую фракцию сыворотки обессоливали гельфильтрацией на сефадексе G-25 в колонке К 26х70, уравновешенным 10 мМ трис-HCI буфером, рН 8,0.

загрузка...