Delist.ru

Современные биотехнологический процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов (09.01.2008)

Автор: Гринь Светлана Анатольевна

7 Мембранные биореакторы (керамический модуль) 109 (перфузия)

культивирования клеток животных

Для практической реализации процесса культивирования клеток животных и вирусов выбран метод культивирования на микрокапсулах и микроносителях.

В результате 5-ти культивирований перевиваемых клеток ПТ-80 на микроносителе «Cytodex-3» при среднем времени культивирования 72 ч средний индекс пролиферации был равен 2.

В целях масштабирования процессов культивирования стадию адсорбции клеток на микроносителе осуществляли непосредственно в биореакторах. При отработке промышленной технологической схемы адсорбции клеток на микроносителе в 25 л биореакторе установлено, что оптимальной посевной концентрацией клеток ПТ-80 является 8-12 кл на микроносителе. Распределение клеток на поверхности микроносителя в конце стадии адсорбции через 2,5-3 часа после добавления в биореактор клеточной суспензии оказалось более равномерным при посевной концентрации 10-12 кл на микроносителе. При этом количество прикрепившихся к микроносителю клеток составляло около 95%. Теоретически рассчитанный при такой посевной концентрации индекс пролиферации клеток ПТ-80 может достигать 6-8, максимальный, полученный в наших опытах, составлял 4,2.

Особое внимание при выборе конструкции биореактора для культивирования клеток животных и вирусов уделяли характеристикам их конструктивных соотношений, материалам узлов биореактора и гидродинамическим условиям культивирования при гарантированном соблюдении асептических условий при длительном культивировании путем сравнения существующих систем культивирования.

2.2.2. Изучение основных факторов, влияющих на гибель клеток при глубинном культивировании в биореакторах

Гибель клеток является основной проблемой при глубинном суспензионном культивировании в биореакторах. Гибель клеток в биореакторе, при прочих равных условиях, может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть объяснены влиянием аэрации с использованием барботажных устройств. Процесс аэрации является необходимым для снабжения клеток достаточных количеством кислорода и углекислого газа. Влияние аэрации можно разделить на влияние самих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков при перемешивании, образовании поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырьков при диспергировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит и при образовании пены.

Если пузырьки образуются в месте барботирования, первоначально они не покрыты защитной пленкой (поверхностно-активных веществ-ПАВ). В период образования и подъема пузырьков, ПАВ адсорбируется на поверхность пузырька.

До достижения критического положения взаимодействие клеток-пузырьков приводит к немедленной гибели клеток. Чем больше молекул ПАВ адсорбируется пузырьком, тем насыщенней он становится и клетки могут далее быть адсорбируемыми пузырьком не будут поврежденными. Адсорбированные клетки могут передвигаться по поверхности пузырька. Если пузырек полностью насыщен, то новые клетки больше не смогут примкнуть к нему, а уже адсорбированные пузырьком поднимаются вместе с пузырьком на поверхность, где они могут затем погибнуть, если пузырек лопнет.

Скорость гибели клеток является простой линейной функцией от интенсивности аэрации F/V(F – скорость потока газа, V – рабочий объем биореактора), для пузырьков диаметром от 4 до 5,5 мм. Эксперименты по барботированию, при которых варьировалось время пребывания пузырьков в культуральной жидкости, четко показали, что гибель клеток в биореакторе не всегда вызывается всплыванием пузырьков. Влияние размера пузырьков и их слияния на скорость гибели клеток требует дальнейшего изучения. Хорошее защитное действие ПАВ от гидродинамических напряжений сдвига при барботировании так же эффективно, как и при перемешивании, предлагается в качестве основного метода и при масштабировании процесса выращивания клеточных культур в биореакторах.

2.2.3. Культивирование клеток сперматогоний

Предложена и испытана четырехпериодная система суспензионного культивирования сперматогоний свиньи.

В первом периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 100 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 5-106 кл/мл.

Культивирование во втором периоде суспензионного культивирования осуществлялось в спиннере емкостью 200 мл, при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза клеток составляла 109 кл/мл.

В третьем периоде культивирование осуществлялось в спиннере емкостью 500 мл при коэффициенте заполнения 0,5. Посевная доза жизнеспособных клеток составила 107 кл/мл.

Прежде, чем приступить к четвертому периоду суспензионного культивирования сперматидов, было проведено концентрирование их заданной дозы на установке BDF-1 с использованием биофильтра Sulzer с 1010 кл/мл до концентрации 5х1015 кл/мл, что соответствует приведенной технологической схеме процесса сперматогенеза клеток семенника поросенка. После концентрирования суспензионное культивирование осуществлялось на спиннере емкостью 1000 мл, коэффициент заполнения 0,5. Концентрация сперматидов составила 5x1015 кл/мл.

Контролируемыми и регулируемыми параметрами явились: температура культивирования, скорость вращения мешалки, рН, еН, рО2, рСО2 и концентрация сперматогоний. Алгоритм управления приведен в табл. 3.

Наиболее сложным и определяющим является четвертый период сперматогенеза в культуральной системе.

С целью создания трансгенных свиней оптимизированные параметры культивирования позволяли получать 5-10% живых клеток, включая сперматогонии, несущие дополнительную информацию.

Таким образом, показана принципиальная возможность поэтапного суспензионного культивирования клеток семенника поросенка в процессе сперматогенеза.

Таблица 3

Алгоритмы управления процессом суспензионного

культивирования сперматидов

Период

сперматогенеза Параметр Уровень

поддержания

Первый период Температура

рСО2 35+0,5°С

7,0-7,1+0,01

-200мв+10%

40% нас. + 10%

5%нac. + 10%

Второй период Температура

рСО2 35+0,5°С

7,2+0,01

-100мв+10%

40% нас. +10%

5%нас.+ 10%

Третий период Температура

загрузка...