Delist.ru

Современные биотехнологический процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов (09.01.2008)

Автор: Гринь Светлана Анатольевна

- впервые разработан «Набор для ранней ИФА-диагностики ринотрахеита КРС»;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса бешенства, штамм «Щелково-51», репродуцированного в культуре клеток ВНК-21;

- впервые разработан метод получения очищенного и концентрированного вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ПТ-80 для КРС, изучены свойства вируса и определены условия и сроки его хранения без потери биологической активности;

- разработаны схемы иммунизации лабораторных животных, обеспечивающие получение высокоактивных и специфических гипериммунных сывороток к вирусу ИРТ КРС и анти-IgG мыши сывороток при разработке тест-системы для индикации антигенов вирусов бешенства и ИРТ КРС;

- впервые разработан метод определения токсичности и реактогенности масляных адъювантов на первичнотрипсинизированных культурах клеток при изготовлении гипериммунных диагностических и лечебных сывороток;

- впервые получена гипериммунная сыворотка для создания пассивного иммунитета у свиней против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза с использованием волов как продуцентов, а в качестве антигенов бралась культура Pasterella multocida серовариантов А штамм 1231, В штамм 681 и Д штамм Т-80, Haemophilus pleuropneumoniae серовара I штамм ГУ-19 и серовара П штамм 5870 и Streptococcus suis серовара II (штамм Касли);

- впервые изобретен способ размножения стромальных клеток, сперматогоний, сперматоцитов и сперматозоидов, включающий в себя их выделение, адаптацию и культивирование вне организма, а также интеграцию (вшивание) в них генетического вектора. Размножение осуществляли в биореакторах поэтапно с использованием на каждом этапе культивирования питательных сред все более сложного состава, обогащенных фетальной сывороткой крупного рогатого скота, энергетическими, гормональными и ферментативными компонентами и поддерживанием физико-химических параметров на оптимальном для каждого этапа уровне. Способ позволяет получить сперматозоиды с генетическим вектором нужной направленности в промышленных масштабах вне организма;

- впервые установлено, что кормление перепелок сбалансированным рационом с добавлением циалитов значительно увеличивает выход культур клеток из перепелиных эмбрионов.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами, в т.ч. 2 заявками (Патент № 2184568 от 10.07.20002г., Патент № 2196336 от 10.01.2003г., Патент № 2196609 от 20.01.2003г., Патент № 2196820 от 20.01.2003г. и Заявки на патент № 2007123692 от 20.06.2007г. и №2007142025 от 15.11.2007г.).

1.4. Практическая ценность работы. Результаты проведенных исследований вошли в НТД производства диагностикумов и лечебных ассоциированных сывороток.

Результаты проведенных исследований использованы при разработке технологии биопрепаратов и включены в 6 нормативных документов на изготовление, контроль и применение диагностикумов ИРТ, ПГ-3, бешенства и хламидиоза, ИФА, РСК, РИФ, РДП и ассоциированных сывороток против гемофилеза, пастереллеза и стрептококкоза.

Все препараты внедрены в производство и ветеринарную практику или производятся и применяются в ветеринарной практике в порядке широкого производственного опыта за период 2001-2007 гг.

За период с 2001 по 2007 гг. выпущены для практического применения в АПК России диагностикумы против вирусов ИРТ ИФА – 500, бешенства РДП – 3500, РИФ – 4000 и хламидиоза РСК – 15000 наборов.

1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Результаты усовершенствования и разработки биотехнологических процессов с использованием современного оборудования и современных иммунобиологических методов при промышленном культивировании микроорганизмов, культур клеток и вирусов и контроля репродукции вирусов и микроорганизмов при промышленном выпуске ветеринарных биопрепаратов.

2. Результаты исследований по использованию при промышленном производстве ветеринарных препаратов современных методов и оборудования для разделения, очистки, концентрирования и инактивации микроорганизмов и вирусов и выделение специфических антигенов и методы их оценки.

3. По результатам оценки токсичности масляных адъювантов и других компонентов на первично трипсинизированной или перевиваемой культуре клеток и практическое использование этого метода для получения гипериммунных сывороток в процессе разработки и промышленного выпуска диагностикумов ИФА ИРТ, РДП и РИФ бешенства, ИРТ, ПГ-3, хламидиоза и ассоциированных лечебных сывороток (гемофилез, стрептококкоз и пастереллез).

1.6. Апробация. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных научных конференциях - Москва (1999-2001 гг.), Киев (2001 г.); Всероссийской научно-практической конференции - Щелково (2000г.); Всероссийской научно-производственной конференции - Ставрополь, (2000г.); Международных научно-практических конференциях - Покров (2000-2002гг.), Новосибирск (2002 г.), Щелково (2003, 2005, 2006 гг.), Москва (2003, 2006 гг.), Крым (2007 г.); Международной биологической научно-практической конференции – Москва (2000г.); Международных научно-практических конференциях молодых ученых – Щелково (2001, 2002, 2004 гг.); заседании секции ветеринарной медицины и биотехнологии - Щелково (2006-2007гг.); на заседаниях ученого совета ВНИТИБП - Щелково (2000-2007гг.).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 68 научные работы, в том числе 6 патентов (из них 2 заявки на патент) и 3 монографии.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты, выводы и практические предложения, содержит 28 таблиц и 36 рисунков. Список литературы включает 612 наименований, из которых 132 отечественных и 480 зарубежных. В приложении представлены копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие Л.К. Эрнст, Е.Э. Школьников, Б.В. Соловьев, В.С. Иванов, А.И Гуславский, Э.Я. Сазанова, сотрудники отделов молекулярная биология и иммунология и оказывали практическую и консультативную помощь, за что приносим им сердечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь сотрудникам, перечисленным в качестве соавторов в списке публикаций по теме.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Культуры клеток и эмбрионы птиц. В работе использовались перевиваемая линия клеток ПТ-80 (почки теленка) и ТАУЭР, культура клеток ВНК 21/13, первичные культуры клеток СП (селезенки поросенка) и семенников, нормальных и обработанных ретровирусом, перевиваемые линии клеток СПЭВ, первичнотрипсинизированные культуры клеток почки, легкого и трахеи эмбриона коровы. Использовали СПФ-яйцо, производимое на ФГУП «Щелковский биокомбинат». Инкубирование яиц проводили в промышленных или лабораторных инкубаторах.

2.1.2. Животные. Использовали морских свинок, мышей, кроликов разных возрастов, свиней, овец и крупный рогатый скот.

2.1.3. Питательные среды и растворы. Использовали культуральные среды Игла, Эрла, 199, полную среду Игла модифицированную Дульбеко (ДМЕМ) (Gibco, Панэко), бессывороточная среда Хенкса с 0,5% лактальбумином; сыворотка КРС, фетальная сыворотка телят и коров (НПО «Вектор», Панэко). Фосфатно-буферный раствор (ФБР) в различных модификациях готовили по стандартным технологиям, растворы бикарбоната натрия, трипсина («Дифко»), 2,5% лактальбумин, ферменты, гормоны, полиэтиленгликоль (ПЭГ) разной концентрации, физраствор.

2.1.4. Масла и эмульгаторы. Использовали масла: вакцинное, ТУ 38101307-72, основы РМ (ГОСТ 15819-70) и АМГ-10 (ГОСТ 6794-75), Ангарское, Маркол 52 (фирма «Эссо», США) и эмульгаторы: ланолин, ФС 42-2520-88, сорбитанолеат, ТУ 18-16-9-81, Монтанид 888 и 103 (фирма «Сеппик», Франция).

2.1.5. Штаммы. Использовали фиксированного вируса бешенства штамм «Щелково-51», вируса ИРТ КРС штамм «ТК А» (ВИЭВ) В2, вируса хламидийного штамм «Улетово», культуры Pasterella multocida серовариантов А «штамм 1231», В «штамм 681» и Д «штамм Т-80», Haemophilus pleuropneumoniae серовара I «штамм ГУ-19» и серовара П «штамм 5870» и Streptococcus suis серовара II («штамм Касли»), респираторно-синцитиального вируса штамм «Randall», вируса ПГ-3 штамм «3КСМ».

2.1.6. Оборудование, технология и технологические средства контроля

Для проведения экспериментов по суспензионному культивированию клеточных культур использовали газовый стерилизатор питательных сред ЕТО фирмы Pharmatec (Германия), спиннеры магнитного типа с блоком управления (t, рН, рО2, рСО2) с перемешиванием фирмы Bellco Biotechnology (США), установка для увеличения клеточной культуры фирмы Pharmatec (Германия), счетчик колонии клеток «Bacfronic» фирмы NBS (США), сосуды Дюара фирмы Forma Scientific, Ins (США) и низкотемпературный холодильник фирмы Forma Scientific, Ins (США), биореакторы АНКУМ-2 (Россия) и «Электролюкс» (Швеция), микропроцессорные управляющие комплексы «Биоцикл МП 01.01»; микроносители Cytodex-3 (НПО «Биолар», г. Олайне) и ВИ-3, изготовляемых во ВНИТИБП по разработанной технологии (Патент РФ № 1255026).

В процессе суспензионного культивирования культур микроорганизмов, клеток и вирусов автоматически контролировались и регулировались основные физико-химические параметры – температура культивирования (tк) и стерилизации биореактора, арматуры и трубопроводов, рН, рО2, еН, давление и вакуум.

В процессе исследований контролировали стерильность питательных сред и растворов общепринятыми методами на МППБ, МПБ, МПА и среде Сабуро.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культивирование культур клеток и вирусов в биореакторах

в суспензии и на микроносителях

Глубинное суспензионное культивирование в биореакторе

Управляемое суспензионное культивирование клеток ПТ-80, ВНК-21/13 проводили в биореакторе емкостью 25 л, разработки ИркутскНИИхиммаш в комплекте с микропроцессорными управляющими комплексами «Биоцикл» и индивидуальными модулями технологической обвязки и управления, разработки и изготовления ВНИТИБП и НПО «Промавтометика».

Контроль и регулирование процесса культивирования осуществлялся по основным технологическим параметрам, приведенным в табл. 1.

Использовали традиционные питательные среды. Индекс пролиферации клеток ПТ-80 и ВНК-21/13 был соответственно 2-4 и 3-6, а накопление клеток в 1 см3 – 0,9-1,3(106.

Таблица 1

загрузка...