Определение метаболизма моноаминов в структурах головного мозга. Выделенные структуры мозга (гипоталамус, гиппокамп и миндалина) размельчали в гомогенизаторе стекло-тефлон при 40С и скорости вращения пестика 3000 об/мин с использованием в качестве среды выделения 0,1 н HСlO4. После этого пробы центрифугировали при 14000 g в течение 7 мин при 40C, после чего супернатант был профильтрован через 0.2 мм Millipore фильтр. Концентрацию дофамина (ДА), норадреналина (НА), серотонина (СА) и их метаболитов ( МГФГ, ДОФУК и 5-ГИУК в гипоталамусе, гиппокампе и миндалине определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на «Beckman System Gold» с электрохимическим детектором LC-4C. Разделение пиков проходило в хроматографической колонке SperoClone 5( ODS 2 (250 mm x 4,60 mm) с предколонкой SecurityGuard (ODS 4,0 mm L x 3,0 mm ID) производства «Phenomenex». В состав подвижной фазы входил 0,1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН = 3,2) (Андреев и соавт., 2002). Идентификацию и чистоту хроматографических пиков, а также их количественную оценку осуществляли по отношению к пикам, полученным от внешних стандартов с использованием пакета компьютерных программ.

Определение уровня половых тропных и периферических гормонов в сыворотке крови. Уровень половых гормонов (лютеинизирующий гормон ( ЛГ, фолликулостимулирующий гормон ( ФСГ, эстрадиол ( Э, прогестерон ( П) определяли в сыворотке крови с помощью гормональных тест-наборов для твердофазного иммуноферментного анализа in vitro у человека (DRG ( Германия, Adultis ( Италия, Biochimmak ( Германия, Хема-Медика ( Италия-Россия) согласно прилагаемой инструкции, но с предварительной раститровкой всех наборов и подбором оптимального разведения сывороток крови крыс, выполнением теста на удвоение и теста внутреннего стандарта для каждого набора. Подсчет результатов производился автоматически с помощью многоканального плашечного спектрофотометра «Униплан» (Россия) при длине волны 450 нм.

). Тотальную РНК выделяли из ~25-30 мг ткани с помощью QiuckPrep Total RNA Extraction kitTM (AmershamPharmaciaBiotech, UK Limited) в полном соответствии с протоколом производителя. Обратную транскрипцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1,0 мкг полирибосомной РНК, 200,0 ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы (M-Mlv обратная транскриптаза, 200,0 Eд/мкл, АмплиСенс, Россия), 1,0 мкМ random-праймера (АмплиСенс, Россия), эквимолярную смесь четырех dNTP по 500,0 мкM каждого (Promega, США), 5XОТ-буфер. Полимеразную цепную реакцию проводили в 30,0 мкл смеси, содержащей 1 мкл синтезированной кДНК, 1,5 ед. рекомбинантной Диа Taq-полимеразы (5,0 Eд/мкл, АмплиСенс, Россия), 1,5 мМ MgCl2, эквимолярную смесь четырех dNTP по 200,0 мкмолей каждого, 6,0 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (АмплиСенс, Россия) и по 0,5 мкМ специфических праймеров (Синтол, Россия). Начальную денатурацию проводили при 940С в течение 5 мин, синтез состоял из 30 циклов, включавших этапы денатурации (940С, 1 мин), отжига (600С для 5-ГТ1А-рецептора, 550С для 5-ГТ2С-рецептора, 570С для Д1-рецептора, 590С для Д2-рецептора, 550С для M-холинорецептора, 590С для Н-холинорецептора, 1 мин) и элонгации (720С, 1 мин). Заключительный цикл элонгации длился 7 мин. Протокол амплификации для 17(-Е2-рецептора: начальная денатурация при 940С в течение 5 мин, 35 циклов: 94 0C 1 мин, 530C 1 мин, 680C 1 мин, и последний цикл элонгации 7 мин 680C. В качестве контроля синтезированных кДНК проводили ПЦР с праймерами к (-актину. Были использованы следующие праймеры: прямой 5’-GAAGATCCTGACCGAGCGTG-3’ и обратный 5’-AGCACTGTGTTGGCATAGAG-3’. Длина ПЦР-продукта составляла 327 п.н. Электрофоретический анализ ПЦР продуктов проводили в 1% агарозном геле. В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры фирмы Сибэнзим (от 1000 п.н. до 100 п.н., отличающиеся друг от друга на 100 п.н.). Определение относительного содержания ЦП-мРНК проводили следующим образом. ПЦР-продукты подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым этидием, цифровые фотографии геля денситометрировали посредством программы Scion Image и результаты выражали как отношение количества образовавшегося ПЦР-продукта данной мРНК к количеству (-актина.

Статистическая обработка результатов

Результаты экспериментов обрабатывали с применением интегрированного пакета статистических программ SPSS 9.0 (StatSoft, Inc). Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (General Linear Model) при Р<0.05. Данные, не удовлетворяющие критериям нормального распределения и не прошедшие тест на равенство дисперсий, обрабатывали с применением теста Краскалла-Уоллиса. В таблицах и графиках результаты экспериментов представлены в виде M ( m, где: М ( среднее арифметическое, m ( среднеквадратичная ошибка среднего арифметического, число животных в группах (N) было 8-10 особей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние серотонинотропных веществ на высшую нервную деятельность у интактных самок крыс

Было выявлено, что при стимуляции 5-ГТ1А-подтипа или при блокаде 5-ГТ2А/2С-подтипа серотониновых рецепторов независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме нарушалась способность к воспроизведению условной реакции пассивного избегания (УРПИ) и существенно угнеталась способность самок к пространственному обучению (рис. 1 и 2).

В то же время, блокада 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов как при низком уровне эндогенных эстрогенов, так и при их высоком уровне приводила к восстановлению процесса воспроизведения УРПИ у крыс (рис. 1). С другой стороны, стимуляция 5-ГТ2В/2С-подтипа серотониновых рецепторов выраженно улучшала пространственное обучение у крыс независимо от уровня эндогенных эстрогенов в организме (рис. 2).

В тесте приподнятый «крестообразный» лабиринт у самок крыс при среднем или низком уровне эндогенных эстрогенов на фоне блокады 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов регистрировался анксиогенный эффект, тогда как при высоком уровне эстрогенов, напротив, проявлялся анксиолитический эффект (табл. 1). При стимуляции 5-ГТ2В/2C-подтипа серотониновых рецепторов при низком или среднем уровне эндогенных эстрогенов уровень тревожности снижался, а при их

Таблица 1

Влияние NAN-190, m-CPP и кетансерина на тревожное поведение

интактных самок крыс

Фаза цикла Время в «открытых рукавах», сек Время в «закрытых рукавах», сек Количество заходов в «открытые рукава», раз Количество заходов в «закрытые рукава», раз

ИНТАКТНЫЕ САМКИ

ДИЭСТРУС 86,4 ( 6,2 213,6 ( 2,4 1,8 ( 0,2 2,1 ( 0,4

ПРОЭСТРУС 36,4 ( 3,4* 263,6 ( 8,6* 0,4 (0,1* 4,5 ( 0,2*

ЭСТРУС 42,6 ( 4,2* 257,4 ( 2,2* 0,3 ( 0,1* 4,0 ( 0,6*

ИНТАКТНЫЕ САМКИ + NAN-190

ДИЭСТРУС 41,2 ( 3,4# 258,8 ( 8,6# 1,2 ( 0,2 2,2 ( 0,2

ПРОЭСТРУС 90,3 ( 3,4# 209,7 ( 6,2# 0,4 ( 0,2 4,0 ( 0,4

ЭСТРУС 23,7 ( 2,2# 276,3 ( 3,8# 0,3 ( 0,1 4,1 ( 0,6

ИНТАКТНЫЕ САМКИ + m-CPP

ДИЭСТРУС 153,4 ( 3,2# 146,6 ( 4,2# 4,2 ( 0,4# 0,8 ( 0,2#

ПРОЭСТРУС 13,8 ( 0,8# 286,2 ( 5,6 0,1 ( 0,02# 3,9 ( 0,8

ЭСТРУС 86,8 ( 5,2# 213,2 ( 7,2# 3,6 ( 0,2# 1,6 ( 0,4#

ИНТАКТНЫЕ САМКИ + КЕТАНСЕРИН

ДИЭСТРУС 83,5 ( 4,2 216,5 ( 2,4 1,6 ( 0,2 2,0 ( 0,6

ПРОЭСТРУС 84,0 ( 4,8# 216,0 ( 5,6# 2,8 ( 0,2# 0,6 ( 0,2#

ЭСТРУС 92,0 ( 6,2# 208,3 ( 4,6# 2,6 ( 0,2# 0,5 ( 0,2#

Примечание: * - р<0,05 (тест Тьюки), достоверное отличие от самок в фазе диэструса; # - р<0,05 (тест Тьюки), достоверное отличие от контрольных самок в соответствующих фазах полового цикла.

высоком уровне ( степень тревожности у самок крыс увеличивалась. Однако блокада 5-ГТ2А/2С-подтипа серотониновых рецепторов однонаправлено вызывала анксиолитический эффект в условиях как низкого, так и высокого содержания эндогенных эстрогенов.

В тесте Порсолта стимуляция 5-ГТ1А- или 5-ГТ2В/2С-подтипов серотониновых рецепторов в условиях низкого или высокого уровня эндогенных эстрогенов оказывала антидепрессивный эффект у самок (рис. 3).

Таким образом, можно говорить о наличии избирательного влияния серотонинотропных веществ на условнорефлекторную деятельность и депрессивноподобное поведение в течение полового цикла. Действие серотонинотропных веществ на тревожное поведение во многом определяется фазой полового цикла.

Согласно данным литературы, 8-OH-DPAT в низких дозах (0,1 - 0,3 мг/кг, подкожно) улучшает кратковременную рабочую память у самцов крыс, тогда как введение 8-OH-DPAT в высокой дозе (1,0 мг/кг, подкожно), напротив, нарушает кратковременную рабочую память и удлиняет латентный период появления рефлекса (Cole et al., 1994; Menenses, Hong, 1995). Это связано с тем, что в низких дозах 8-OH-DPAT действует на пресинаптические рецепторы, а в высоких дозах ( на постсинаптические 5-ГТ1А-рецепторы (Bethea et al., 2002). Выявлено, что NAN-190 (1,0 мг/кг, внутрибрюшинно) улучшал различные виды памяти у самцов крыс (Ohno, Watanabe, 1996; Souza et al., 2001). Работы Diaz-Veliz и соавторов (1997) показали, что однократное введение кетансерина (3,0 мг/кг, подкожно) за 30 минут до тестирования проявляло анксиолитический эффект в фазу диэструса, но анксиогенный эффект ( в фазы эструса и проэструса, при этом кетансерин в данной дозе не оказывал какого-либо влияния на тревожное поведение у самцов крыс. У самок, получавших кетансерин, не было выявлено воспроизведения УРПИ в фазы диэструса и метэструса, но в фазу эструса при введении этого препарата отмечалось воспроизведение УРПИ. На УРАИ кетансерин оказывал позитивное влияние в фазу эструса, однако нарушал способность у животных к этой форме обучения в фазу диэструса (Diaz-Veliz et al., 1997).

Влияние серотонинотропных веществ на уровень тропных и периферических половых гормонов в крови, обмен биогенных аминов и экспрессию генов рецепторов нейромедиаторов и 17(-эстрадиола в головном мозге у интактных самок крыс

При изучении нейрохимических механизмов действия серотонинотропных препаратов на мнестические функции мозга было выявлено, что данные гормонального и нейромедиаторного статуса, а также результаты экспрессии генов рецепторов нейромедиаторов и 17(-Е2 у самок в фазу эструса или проэструса, получавших исследуемые вещества, не коррелируют отчетливо с результатами, обнаруженными в поведенческих тестах. Можно говорить только о существовании модуляции протекания биохимических процессов в зависимости от фазы полового цикла под действием серотонинотропных веществ, что в конечном итоге выражается и в модуляции условнорефлекторной деятельности. Вместе с тем, нельзя недооценивать те биохимические и поведенческие эффекты, которые оказывают серотонинотропные вещества при их применении в течение полового цикла в эксперименте, поскольку эти нейротропные вещества глубоко изменяют функциональное состояние всей гипоталамо-гипофизарно-овариальной системы.

Влияние серотонинотропных веществ на высшую нервную деятельность у овариоэктомированных самок и овариоэктомированных самок, получавших 17(-эстрадиол

Изолированное или комбинированное с низкой дозой 17(-E2 хроническое введение агониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов – 8-OH-DPAT или антагониста 5-ГТ2А/2C-подтипа серотониновых рецепторов – кетансерина ОЭ самкам оказывало позитивное влияние на процессы обучения и памяти как на модели непространственного обучения – модель УРПИ, так и на модели пространственного обучения – водный тест Морриса (рис. 4, 5, 6 и 7). При этом, введение 8-OH-DPAT или кетансерина ОЭ самкам, получавшим 17(-E2 и без него, сопровождалось снижением уровня тревожности в тесте приподнятый «крестообразный» лабиринт ([F(7,36) = 3,40, p<0,05] и [F(5,72) = 21,95, p<0,01], соответственно) и степени депрессивности в тесте Порсолта ([F(7,36) = 2,88, p<0,01] и [F(5,72) = 5,97, p<0,01], соответственно).

В то же время, изолированное или сочетанное с 17(-E2 хроническое введение антагониста 5-ГТ1А-подтипа серотониновых рецепторов – NAN-190 вызывало антиамнестический эффект у ОЭ самок на разных моделях обучения и не оказывало какого-либо влияния на эмоциональные формы поведения. Необходимо также отметить, что позитивные поведенческие эффекты самого 17(-E2 у ОЭ самок на фоне введения NAN-190 полностью блокировались. Вместе с тем, введение агониста 5-ГТ2B/2C-подтипа серотониновых рецепторов ОЭ самкам – m-CPP только частично проявляло позитивное действие на условнорефлекторную деятельность. Такие эффекты препарата могут быть обусловлены его способностью действовать не только на 5-ГТ2B- или 5-ГТ2C-подтипы серотониновых рецепторов, но и на 5-ГТ1B- и 5-ГТ1Д-подтипы серотониновых рецепторов, хотя и в меньшей степени (Bethea et al., 2002).