Delist.ru

Морфологические и молекулярно-биологические особенности патологии легких, развившейся в условиях повышенной радиации (07.09.2007)

Автор: Сагиндикова Гульмира Елеусиновна

Проведенное исследование показало, что основным тканевым источником ММР-1, -2, -9 и TIMP-1 в очагах ФКТ являются клетки гранулем и СD68+ макрофаги воспалительного инфильтрата. Обнаруженная высокая активность MMPs в клетках гранулемы и макрофагальном инфильтрате может обеспечивать с одной стороны миграцию клеток в очаг воспаления, что приводит к образованию гранулем, а с другой – деструкцию экстрацеллюлярного матрикса и базальных мембран и развитию казеозного некроза. Судя по тому, что в основной группе преобладали деструктивные изменения и реже развивались гранулемы, по сравнению с контрольной группой, а уровни активности MMPs в их клетках были значительно выше, можно предположить, что при различных уровнях ММРs может смещаться баланс между этими процессами. Так, при меньшей активности MMPs доминируют процессы формирования гранулем, при более высокой – казеоза. Наши данные совпадают с результатами исследований, в которых показано, что образование каверн напрямую связано с активацией экспрессии генов ММР-1 и ММР-7. При этом установлено, что усиление образования MMP-2 и ММР-9 в моноцитах гранулемы стимулируется рядом цитокинов, прежде всего TNF-?. Ингибиторы MMPs, такие как ВВ-94, стимулируют фиброзирование и подавляют миграцию моноцитов в ходе образования гранулем. В макрофагальном инфильтрате основной группы обнаруживается экспрессия MMPs и TIMP-1 в отличие от контрольной группы, где выявлена активность только MMP-1 и -9.

Как показало проведенное исследование, активность MMP- 2 связана не только с деструкцией тканей при ФКТ, но и с процессами неоангиогенеза и фиброза, что подтверждается наиболее высокими показателями ММР-2 в эндотелии сосудов и в фибробластах стромы. При этом в основной группе эти процессы выражены достоверно выше, что может указывать на воздействие, потенциирующее фиброз как туберкулезного, так и радиационного факторов у пациентов Семипалатинского региона.

В бронхиальном эпителии очагов плоскоклеточной метаплазии (ПМ) основной группы наблюдается высокая экспрессия MMPs и их ингибитора TIMP-1, что отчасти может быть связано с активирующим воздействием на эпителий цитокинов, выделяемых CD68+ макрофагами и клетками гранулем. В контрольной группе эпителий очагов ПМ не экспрессирует металлопротеиназ. Как было показано в экспериментальных исследованиях, секреция MMPs бронхиальным эпителием при туберкулезе индуцируется цитокинами, выделяющимися активированными макрофагами, которые также способны снижать секрецию эпителием ингибиторов металлопротеиназ [Price N.M., 2003]. MMP-2, ММР-9 и ММР-1 экспрессируются при ФКТ в эпителиальных клетках, что крайне опасно, поскольку может приводить к злокачественной трансформации и началу инвазивного роста. Инвазивному росту также может способствовать усиление ангиогенеза в подлежащих тканях, судя по повышенной экспрессии VEGF и CD34.

Ангиогенез и фиброзирование в очагах ФКТ оценивались нами по относительной плотности новообразованных сосудов, эндотелий которых экспрессирует CD34, содержанию VEGF и TGF-? в клетках очагов. VEGF выявляется в цитоплазме клеток. Установлена экспрессия фактора роста как эндотелием сосудов, так и стромальными клетками вблизи гранулем (см. рис. 8д). При этом в контрольной группе основными источниками VEGF являются клетки гранулем, макрофаги инфильтрата, а в основной группе – эпителиоидные и гигантские клетки гранулем и макрофаги инфильтрата, а также эндотелий сосудов. Высокий уровень экспрессии VEGF в ФКТ коррелировал с высокой плотностью новообразованных сосудов (р? 0,01).

При CD34 плотность сосудов значительно варьировала в зависимости от выраженности воспалительной реакции. Однако, в целом, обнаружено относительное увеличение плотности сосудов в очагах вблизи гранулем. В образцах ткани контрольной группы больных, проживавших на территориях с неизмененным радиационным фоном, плотность сосудов была ниже по сравнению с основной группой (р? 0,001).

Таким образом, ангиогенез в ФКТ в целом повышается. Усиление ангиогенеза наиболее выражено вблизи гранулем с нейроэндокринной и базальной дифференцировкой эпителиальных клеток, продуцирующих VEGF.

TGF-b в основной группе выявляется как в клетках бронхиального эпителия вблизи гранулем, так и эпителиоидными и гигантскими клетками гранулем и макрофагами инфильтрата (см. рис. 8е). В контрольной группе TGF-? выявляется лишь эпителиоидными и гигантскими клетками гранулем и макрофагами инфильтрата (р? 0,001).

, 2000].

Резюмируя выше изложенное, можно отметить следующие особенности ФКТ у лиц, длительное время проживавших на радиоактивно-загрязненных территориях Семипалатинской области: большая выраженность деструктивных и фибротических изменений; снижение частоты выявляемости гранулематозного воспаления и наличие слабой местной лимфоидной инфильтрации, что косвенно может свидетельствовать о низком уровне развития клеточного иммунитета на фоне воздействия ионизирующего излучения; выраженность деструктивных процессов и фиброзирования при ФКТ зависит от активности MMPs, их ингибиторов, факторов ангиогенеза, множества факторов роста и других цитокинов, содержание которых значительно выше у больных ФКТ, проживавших в условиях повышенной радиации; клетки гранулем и СD68+ макрофаги воспалительного инфильтрата являются основным тканевым источником ММР-1, -2, -9 и TIMP-1 в очагах ФКТ.

4. Морфологические и молекулярно-биологические особенности предраковых процессов легких населения Семипалатинского региона Казахстана с повышенным уровнем радиации.

На I этапе исследования изучали морфологию и иммуногистохимическую характеристику предрака легкого. Мы исследовали очаги АБГ, ДIII бронхиального эпителия, ААГ без/на фоне фиброза и ГНК, раздельно в клетках эпителия, стромы, сосудах и клетках воспалительного инфильтрата. Кроме того, в качестве контроля исследовались бронхи без патологических изменений в участках сохранного легкого.

Дисплазия Ш бронхиального эпителия выявлена у 26 (12 - основной группы, 14 – контрольной группы) больных в бронхах разного калибра в виде очагов, состоящих из атипичных клеток плоского эпителия, обнаруживаемых во всех его слоях. Подлежащая базальная мембрана утолщена, гиалинизирована. В подлежащих тканях отдельные сосуды капиллярного типа и лимфоплазмацитарные и макрофагальные инфильтраты.

Атипическая базальноклеточная гиперплазия обнаружена у 43 (12 и 31) пациентов в бронхах разного калибра в виде очагов гиперплазии и атипии базальных клеток. Базальная мембрана в фокусах АБГ утолщена, гиалинизирована, в подлежащих тканях имеется инфильтрация лимфоидно-плазматическими клетками и макрофагами, а также сосуды капиллярного типа с гиалинизированными стенками.

Гиперплазия нейроэндокринных клеток обнаружена у 4 больных основной группы и 2 пациентов контрольной группы. Обращает на себя внимание утолщение базальной мембраны в фокусах ГНК, множество сосудов капиллярного типа с гиалинизированными стенками и лимфоплазмацитарная и макрофагальная инфильтрация в подлежащих тканях.

Атипическая аденоматозная гиперплазия найдена у 38 (13 и 25) пациентов, как правило, локализуется в субплевральных отделах легкого или в легочной паренхиме и не связана с бронхами. ААГ представлена аденоматозными альвеолярными, тубулярными и сосочковыми структурами, выстланными полиморфными эпителиальными клетками, наслаивающимися друг на друга. В большинстве случаев строма в этих участках расширена, представлена фиброзной гиалинизированной тканью, содержащей единичные сосудистые структуры, большое количество пылевых частиц, и небольшие скопления лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов. При окраске по Ван Гизону обнаруживаются грубые коллагеновые волокна красного цвета.

Ki-67-положительные клетки в основном локализуются в базальной и парабазальной областях, а при выраженной пролиферации и атипии базальных клеток – на всех уровнях эпителиального пласта. Уровень экспрессии Ki-67 в эпителиальных клетках основной и контрольной групп при ДIII составляет в среднем 9%, при АБГ 4,1% (р?0,05), при ААГ 6,4% (р?0,01), при ГНК в нейроэндокринных клетках в среднем достигает 3,9% (Рис. 9а).

Хромогранин. В контрольной группе больных хромогранин выявлялся в отдельных случаях ДIII, ААГ и АБГ в единичных клетках эпителиального пласта. В группе пациентов из Семипалатинского региона хромогранин был значительно выше и составлял в среднем 30% при ДIII и ААГ (р?0,001), 35% при АБГ (р?0,001) (Рис. 9б).

При окраске гематоксилином и эозином ГНК первоначально была диагностирована нами как АБГ, а в одном случае - как плоскоклеточная метаплазия бронхиального эпителия. Диагноз ГНК ставился нами после выявления нейроэндокринных клеток при реакции на хромогранин А.

На II этапе исследовались матриксные металлопротеиназы (ММРs) и их ингибиторы. ММР-1 при иммуногистохимическом исследовании выявляется в цитоплазме клеток. В очагах предраковых изменений в легком обнаружено отличие в экспрессии данного фермента как по уровню, так и по локализации в двух исследуемых группах. В тканях больных I группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-1 в эпителии предраковых очагов, а также в эндотелии сосудов и фибробластических элементах стромы. При этом, наиболее высокий уровень экспрессии ММР-1 в эпителиальных клетках отмечается при АБГ и ДIII (р?0,001) (Рис. 9в).

ММР-2 и ММР-9 при иммуногистохимическом исследовании выявляется также в цитоплазме клеток. В тканях больных основной группы отмечалось повышение уровня экспрессии ММР-2 и ММР-9. Продукт реакции обнаружен также и в эпителии предраковых очагов, и в фибробластических элементах стромы. При этом, наиболее высокий уровень экспрессии ММР-2 в ДIII, а ММР-9 отмечается при АБГ (р?0,001) (Рис. 9г,д).

Рис. 9. MMP-1,-2,-9, TIMP-1, VEGF, CD34, хромогранин А и Ki-67 при предраке легкого.

Условные обозначения смотри по тексту.

TIMP-1 при иммуногистохимическом исследовании выявляется также в цитоплазме клеток. В тканях больных I группы отмечалось повышение уровня экспрессии TIMP-1 в эпителии предраковых очагов, эндотелии сосудов и в фибробластических элементах стромы. Наиболее высокий уровень экспрессии TIMP-1 отмечается при ДIII (р?0,01) (Рис. 9е).

В образцах ткани контрольной группы больных, проживавших на территориях с неизмененным радиационным фоном, выявлена низкая экспрессия протеазы ММР-1, как правило, клетками воспалительного инфильтрата стромы, прежде всего макрофагами – СД68+ клетками.

В образцах ткани II группы больных выявлена низкая экспрессия ММР-2 и -9. В эпителиальных клетках продукт реакции не обнаруживался. Небольшие количества ММР-2 и -9 определялись в эндотелии сосудов и в клетках воспалительного инфильтрата стромы.

Экспрессия TIMP-1 в образцах ткани контрольной группы больных обнаружена в основном в клетках воспалительного инфильтрата, прежде всего макрофагами – СД68+ клетками в сочетании с низкой экспрессией клетками эпителия и эндотелия сосудов.

В дополнение к имеющимся литературным данным об участии ММРs и TIMP в процессах инвазии и метастазирования рака легкого (РЛ), в первую очередь мелкоклеточного РЛ [Zhou Y., 2005, Coussens L.M., 2002, Gonzales-Avila G., 1998], нами установлено усиление экспрессии данных молекул и в предраковых очагах, что может свидетельствовать о подготовке клеток таких очагов к инвазивному росту. Кроме того, повышение активности ММРs приводит к активации факторов роста (эпидермоидного фактора роста, фактора роста фибробластов, фактора роста эндотелия сосудов и др.), которые в свою очередь, могут способствовать пролиферации эпителия и неоангиогенезу. Полученные нами данные могут быть использованы для разработки методов таргетной терапии предраковых процессов в легких, направленных на подавление процессов пролиферации и ангиогенеза путем ингибирования ММРs и активации TIMP. Можно предположить, что данный подход к лечению заболеваний на стадии предраковых изменений в легких будет более эффективен по сравнению с терапией РЛ [Zhou Y., 2005].

Выявлены различия в содержании металлопротеиназ и их ингибитора в идентичных очагах контрольной и основной групп, которые характеризуются появлением экспрессии ММР-1, -2 и -9 и относительным увеличением экспрессии TIMP-1 в эпителиальных клетках основной группы. Злокачественный потенциал предраковых процессов легкого в плане инвазивного роста значительно выше в I группе, что вероятно и определяет худший прогноз радиационного рака [Yamamoto T., 1986]. Онкогенный эффект при воздействии малых доз радиации изучен давно и не вызывает сомнений [Бабешко В.Г., 1991, Латарне Р., 1990, Hill C, 1990, Hoel D.G., 1990, Shimuzu G., 1991].

Высокие показатели экспрессии ММРs в основной группе могут быть связаны с нейроэндокринной дифференцировкой клеток предраковых очагов [Gonzales-Avila G., 1998].

CD68. Процентное содержание CD68 положительных клеток среди клеток инфильтрата при ДIII составляет 9 и 10% в исследованных группах пациентов (р?0,05). Отмечается относительный рост процентного содержания CD68 положительных клеток до 31% и до 17% среди клеток инфильтрата в основной группе пациентов с АБГ (р?0,001) и ГНК (р?0,001) по сравнению с контрольной группой, где он составил по 3%. При ААГ процентное содержание CD68 положительных клеток среди клеток инфильтрата составляет 8 и 15% в I и во II группах пациентов (р?0,001).

На III этапе изучался ангиогенез. Ангиогенез в легочном интерстиции, прилежащем к предраковым очагам, оценивался нами по относительной плотности новообразованных сосудов, эндотелий которых экспрессирует CD34 и экспрессии VEGF.

VEGF выявляется в цитоплазме клеток предраковых очагов. Установлена экспрессия фактора роста как эпителиальными, так и стромальными клетками очагов. При этом в контрольной группе основными источниками VEGF являются клетки воспалительного инфильтрата, а в основной группе – клетки эпителия и воспалительного инфильтрата. Высокий уровень экспрессии VEGF в АБГ и ГНК коррелировал с высокой плотностью новообразованных сосудов (р?0,001) (Рис. 9ж).

При CD34 плотность сосудов значительно варьировала в зависимости от выраженности воспалительной реакции. Однако, в целом, обнаружено относительное увеличение плотности сосудов в очагах предрака по сравнению с нормой. Плотность сосудов уменьшалась в очагах от АБГ, ГНК, ДIII до ААГ. В образцах ткани контрольной группы больных, проживавших на территориях с неизмененным радиационным фоном, плотность сосудов была ниже в АБГ (р?0,01) и ГНК (р?0,001) по сравнению с основной группой (Рис. 9з).

Таким образом, ангиогенез в предраковых очагах в целом повышается по сравнению с нормой. Усиление ангиогенеза наиболее выражено в предраковых очагах с нейроэндокринной и базальной дифференцировкой эпителиальных клеток, продуцирующих VEGF, что сопоставимо с данными литературы [Gonzales-Avila G., 1998, Kawano N., 1997].

В результате проведенного исследования установлена высокая частота экспрессии хромогранина в эпителиальных клетках, что совпадает с данными, опубликованными ранее [Коган Е.А., Парамонова Н.Б., 2003]. Предрак легкого, возникший в условиях повышенной радиации, отличается высоким потенциалом к инвазивному росту, судя по повышению уровня экспрессии ММР-1, -2 и -9 в эпителиальных клетках, а также усиления ангиогенеза в подлежащих тканях при АБГ, ГНК. Полученные данные совпадают с данными литературы о высоком риске развития РЛ при высокой активности и наличии генетического полиморфизма ММР-2 и ММР-9 [Zhou Y., 2005]. При этом компенсаторно происходит активация механизмов антибластомной защиты путем усиления выработки TIMP-1 и высокого процентного содержания CD68+ макрофагов среди клеток инфильтрата, сдерживающих прорастание эпителия через базальную мембрану. Относительно высокий уровень металлопротеиназ в радиационном предраке может быть косвенным подтверждением возникновения предрака в условиях радиационного фиброза и свидетельством его высокого злокачественного потенциала.

Особенностью предрака легкого семипалатинского региона является также большой процент молодых пациентов. Возраст больных колебался с 18 до 69 лет, в то время как в контрольной группе возраст больных составлял 47-81год.

MMP-2, ММР-9 и ММР-1 экспрессируются в предраке легкого в эпителиальных клетках, что крайне опасно, поскольку может приводить к началу инвазивного роста. Инвазивному росту также может способствовать усиление ангиогенеза в подлежащих тканях, судя по повышенной экспрессии VEGF и CD34 при АБГ и ГНК.

MMP-2, ММР-9 и ММР-1 экспрессируются в предраке легкого в эпителиальных клетках, что крайне опасно, поскольку может приводить к началу инвазивного роста. Инвазивному росту также может способствовать усиление ангиогенеза в подлежащих тканях, судя по повышенной экспрессии VEGF и CD34 при АБГ и ГНК.

Таким образом, предрак легкого, возникший в условиях повышенной радиации, отличается рядом молекулярных особенностей: наличием высокого потенциала к инвазивному росту за счет дисбаланса между экспрессией металлопротеиназ и их ингибиторов, а также активацией механизмов антибластомной защиты; усиленным ангиогенезом в строме подлежащих тканей, что также создает благоприятные условия для инвазивного роста трансформированного эпителия; повышением уровня пролиферации эпителия за счет возможной активации факторов роста под действием ММРs и их усиленной продукции.

Относительно высокий уровень металлопротеиназ в предраке основной группы может быть косвенным подтверждением возникновения предрака в условиях радиационного фиброза и свидетельством его высокого злокачественного потенциала.

загрузка...