Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

Воздействия Скелетные мышцы крысы Гладкие мышцы моллюска

Без КТ +КТ Без КТ +КТ

Без пептидов 39.7±3.4 48.5±2.0 63.2±4.1 69.1±9,6

(100%) (100%) (100%) (100%)

Инсулин 67.9±3.6 48.2±2.7 200.5±14.4 74.2±7.6

10-9М (171%) (99%) (317%) (108%)

ИФР-1 57.4±2.1 43.1±1.6 139.2±12.4 76.8±7.3

10-9М (145%) (89%) (220%) (111%)

Без ХТ +ХТ Без ХТ +ХТ

Без пептидов 39.6±2.6 79.7±2.7 47.4±3.0 94.3±5.6

(100%) (100%) (100%) (100%)

Инсулин 69.3±2.8 105.8±7.4 151.7±9.8 134.0±7.5

10-9М (175%) (133%) (320%) (142%)

ИФР-1 56.7±4.2 106.2±6.5 100.0±5.4 122.6±8.8

10-9М (143%) (133%) (210%) (130%)

Примечание: В скобках – активность АЦ в %. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.

Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют ?-субъединицы Gi и Gs белков.

Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование ?i-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что ??-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на ?i-субъединицу и ?? димер в условиях действия коклюшного токсина.

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через ??-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.

Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности ?s-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l.

Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1.

Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10-9–10-7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10-9–10-7М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.

Таблица 8. Влияние вортманнина (10–9М–10–7М) на стимуляцию ИФР-1 (10–8М) и инсулином (10–8 М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea.

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)

объекты

Моллюски

воздействия без пептида ИФР-l инсулин без пептида ИФР-l инсулин

без ворманнина 21±1.6 38.2±1.0* 41.4±2.3* 17.8±1.0 41.1±2.6* 24.5±1.0*

+вортманнин

10–9М 17.9±2.0 9.4±1.3 9.7±1.4 15.8±2.0 14.6±1.3 14.2±0.4

+вортманнин

10–8М 16.5±2.3 8.6±1.3 8.4±1.3 14.6±2.3 13.9±0.8 11.6±1.0

+вортманнин

10–7М 13.2±1.9 6.3±0.9 6.8±0.8 14.3±0.9 13.8±1.8 7.4±0.5

Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.

Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС – кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (10-10–10-8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10-8М. В присутствии кальфостина