ПЛЕСНЁВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Биохимия 03.00.04

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, Российской Академии наук (зав. лабораторией д.б.н., проф. М.Н. Перцева)

Научный консультант доктор биологических наук, профессор,

Перцева М.Н.

Официальные оппоненты доктор биологических наук,

Аврова Н.Ф.

Доктор биологических наук,

Пучкова Л.В.

Доктор биологических наук,

Авдонин П.В.

Ведущее учреждение Физиологический Институт

им. А.А. Ухтомского

Санкт-Петербургского

Государственного Университета

Защита состоится 23 октября 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан _____сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.127.01

доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

Актуальность проблемы

Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (G-белки) стимулирующего (Gs) или ингибирующего (Gi) типа, состоящие из трех субъединиц – ?, (, ? и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника – циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).

К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов – клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992).

К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использовали эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные – крысы, птицы и беспозвоночные – моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.

Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов – клеточный рост, апоптоз.

Задачи исследования

1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.

2. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а) установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-3-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.

3. Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000).

4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии – сахарный диабет 1-го и 2-го типов.

Научная новизна.

Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков (Gi) и (Gs) типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС - ПКС( и возможно ПКС?.

В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клетке следующей сигнальной цепью: рецептор тирозинкиназного типа ( Gi-белок ((?-димер) ( ФИ-3-К ( ПКС( (позвоночные) или ПКС? (беспозвоночные) ( Gs-белок ( АЦ ( цАМФ ( протеинкиназа «А» (ПКА) ( эффекторные системы. Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного в клетке следующей цепью: рецептор серпантинного типа ( G-белок (Gi или Gs) ( АЦ ( цАМФ ( ПКА ( эффекторные системы.

Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКС?, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, – ПКС?.

Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке. Показано участие АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток.