Динамика ЭхоКГ в исследуемых группах. Исходно показатели в исследуемых группах не различались. При моделировании и лечении острой ишемии миокарда во всех группах после коронароокклюзии отмечалось достоверное увеличение КДРлж, снижение ФВ, VAo, однако неодинаковое в сравниваемых группах: наименьшие нарушения происходили в группе животных, получавших интрамиокардиально трансплантацию культивированных ММСКАКМ, а наибольшие - в группе с интрамиокардиальной трансплантацией МФКАКМ. Через 1 год после операции было зарегистрировано выраженное положительное влияние интрамиокардиальной отрансплантации культивированных ММСКАКМ, проявляющееся в нормализации всех показателей. В то время как у животных после интрамиокардиальной аутотрансплантации МФКАКМ, наоборот, выявлялось резкое снижение показателей систолической функции левого желудочка по сравнению с контрольной группой. Динамика показателей остальных исследуемых групп не отличалась от контроля. При моделировании и лечении постинфарктного кардиосклероза и хронической ишемии миокарда во всех группах исходно были одинаково резко снижены показатели систолической функции левого желудочка сердца. Через 6 месяцев только в группе животных, с интракардиальной трансплантацией МФКАКМ отмечена достоверная (p<0,05) положительная динамика показателей: ФВ и VAo- повысились по сравнению с исходными, соответственно: с 45,7±3,7% до 56,6±1,2% и с 72±8 м/сек до 83±8 м/сек; КДРлж уменьшился с 16,8±0,7 мм до 15,9±0,8 мм.

Количественная оценка васкуляризации. Через 12 месяцев после моделирования и лечения острого инфаркта миокарда отмечено достоверное различие в вскуляризации зоны поврежденного миокарда: после интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга и ФРС плотность микрососудов на единицу площади была не только достоверно больше (p<0,05), чем в контрольной группе и группах, получавшей плацебо, но и различалась характером микрососудов: они имели в большинстве своем регулируемую стенку, тогда как в контрольной группе в зоне повреждения формировались микрососуды синусоидного типа. В остальных группах различий с контролем не было зарегистрировано (рис.2 А)

Через 6 месяцев после лечения постинфарктного кардиосклероза в группе животных, где выполнялась интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ отмечено достоверно большее число микрососудов по сравнению с контролем и группой, получавшей плацебо: 20±3 против 9±3 в одном поле зрения, при этом в опытной группе они преимущественно имели характер сосудов регулируемого типа, а в контрольной группе – синусоидов (рис.2 В)

Рис.2 Количество микрососудов регулируемого и синусоидного типа в единице площади зоны повреждённого миокарда А- через 12 месяцев после моделирования и лечения инфаркта; В – через 6 месяцев после лечения постинфарктного кардиосклероза в сравниваемых исследованных группах кроликов. Обозначение - ось ординат - количество микрососудов в 1 поле зрения площади инфаркта миокарда; ось абсцисс – исследуемые группы

Морфометрическая характеристика сердец. Через 12 месяцев после моделирования и лечения острого инфаркта миокарда макроскопическое исследование нативных сердец кроликов в контрольной, получавших плацебо, интравенозную трансплантацию клеток костного мозга, 70% животных из группы, получивших интрамиокардиальное введение ФРС, существенно не отличались друг от друга: наблюдалось увеличение размеров сердца и наличие аневризмы левого желудочка по сравнению со здоровым сердцем (неоперированные животные). В сердцах кроликов, которым выполнялась интрамиокардиальная трансплантация культивированных ММСКАКМ и у 30% животных из группы, получивших интрамиокардиальное введение ФРС в передней стенке левого желудочка выявлялись рубцовые изменения, но не было аневризмы и размеры сердца были незначительно увеличены. В группе животных, которым осуществляли интрамиокардиальную трансплантацию МФКАКМ, размеры сердца значительно превышали размеры здорового сердца, а левый желудочек был аневризматически изменен. Площадь рубца и индекс дилатации левого желудочка составляли соответственно: 20,2±1,9% и 0,19±0,02- в контроле, группах плацебо и с внутривенным введением клеток костного мозга 35,8±1,6% и 0,34±0,03 - в группе после интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ и 6,0±2,6% и 0,11±0,02 в группе после интрамиокардиальной трансплантации культивированных ММСКАКМ.

Через 6 месяцев после лечении хронической ишемии миокарда и постинфарктного кардиосклероза сердца кроликов опытной группы значительно отличались от контроля и группы. получавших плацебо: размеры сердца были меньше, на передней стенке и верхушке левого желудочка видны мелкие рубцы и не выявлялось аневризмы. Индекс дилатации в группах соответственно составил: 0,13±0.03 и 0,19±0,03.

Гистологическая характеристика миокарда. Было выявлено, что при моделировании и лечении острого инфаркта миокарда что интрамиокардиапьная трансплантация и МФКАКМ приводила через 12 месяцев к формированию принципиально отличной от контрольной группы морфологической структуры миокарда. После трансплантации культивированных ММСКАКМ наблюдалась картина мелкоочагового склероза с последующим восстановлением структуры миокарда. Интрамиокардиальная трансплантация МФКАКМ сопровождалась формированием фиброзной аневризмы с поражением не только левого но и правого желудочка.

Через 6 месяцев при лечении хронического кардиосклероза в контрольных группах гистологически определялся трансмуральный рубец с большим количеством фибробластов и коллагеновых волокон., а в опытной группе – у половины животных - субэндокардиальные рубцы (фиброз), и островки субэпикардиального фиброза, не распространяющиеся на межжелудочковую перегородку, у другой половины животных имелся участок ограниченного небольшого не полностью трансмурального рубца (присутствовал слой кардиомиоцитов со стороны эндокарда. В зоне повреждения отмечалось множество функционирующих кардиомиоцитов, окруженных большим количеством регулируемого типа мелких сосудов с периваскулярным фиброзом.

Оценка безопасности методов стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде. Интраоперационная, послеоперационная летальность во всех сравниваемых группах достоверно не различались и составили соответственно в среднем 10±3% и 10±4 %. Количество гнойно-воспалительных осложнений со стороны зоны операции в группах животных, получавших интрамиокардиальную трансплантацию клеток костного мозга было достоверно (p< 0,05) ниже , чем в других группах. Через 1- 2 года после интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга и ФРС макроскопически у животных при осмотре внутренних органов не было выявлено признаков злокачественных новообразований, а в местах трансплантации клеток костного мозга не обнаружено их патологической дифференцировки.

Влияние цитомединов на развитие органотипической культуры миокарда новорожденных крыс. В группе, где в культуральную среду добавлялся цитомедин кордиален, наблюдалась достоверная (p<0,05) стимуляция зоны роста: ИП увеличивался на 52±5 % по сравнению с ИП контрольной группы. Остальные исследуемые препараты вызывали незначительные вариации значений ИП, практически не отличающиеся от ИП контрольной группы.

Результаты пилотного исследования интракардиальной трансплантации МФКАКМ в комплексном хирургическом лечении больных ПКС.

Результаты культивирования клеток костного мозга в сравниваемых возрастных группах оказались схожими и доказали наличие как ГСК, так и МСК. После 14 дневного культивирования клеток костного мозга в питательной среде на основе метилцелюлозы во всех случаях формировались типичные колонии предшественников гемопоэза. Среднее количество колониеобразующих единиц (КОЕ ГМ и БОЕ Э) у больных ПКС не отличалось в сравниваемых возрастных группах и соответствовало показателям здорового человека. Цитофлюориметрическим методом было показано, что среди ядросодержащих клеток костного мозга число CD 34+ клеток составляло в среднем 2,1±0,6% и также не различалось в сравниваемых возрастных группах больных ПКС. Культивированные стромальные клетки костного мозга 2-5 пассажа представляли собой гетерогенную популяцию адгезивных к пластику клеток, имеющих в суспензии после ферментативной обработки диаметр 15-80 мкм. Через 3 недели культивирования по данным иммунофенотипирования эксплантированные стромальные клетки могли быть отнесены к МСК.

Интраоперационный период. Длительность процедуры миелоэксфузии составила в среднем 14±4 минуты. Ни в одном случае каких-либо осложнений, связанных с забором костного мозга, не отмечено. Время выделения мононуклеарной фракции клеток костного мозга составило от 80 до 119 (в среднем 100±19) минут, поэтому подготовка трансплантата не требовала удлинения обычных сроков кардиохирургического вмешательства. Трансплантация клеток осуществлялась интрамиокардиально + в дистальный отдел аорто- или маммарокоронарного анастомоза у 3 пациентов, интрамиокардиально + селективно в коронарные артерии - у 7 пациентов. Длительность процедуры клеточной трансплантации составила от 4 до 8 (в среднем 6±2) минут. Гематом и кровотечения в зонах интрамиокардиальной клеточной трансплантации не отмечено. У 6 больных наблюдалось самостоятельное восстановление сердечной деятельности, 4 больным потребовалась дефибрилляция. Синусовый ритм зарегистрирован у 8 пациентов (в том числе у одного больного, имевшего перед операцией постоянную форму мерцательной аритмии), фибрилляция предсердий - у 2 пациентов (в том числе у одного больного с митральным пороком и дилатацией левого предсердия, имевшего перед операцией синусовый ритм). Адренергическая поддержка в связи с миокардиальной слабостью потребовалась 4 пациентам. Длительность оперативного вмешательства в обследуемой группе пациентов не отличалась от обычных показателей.

Послеоперационный госпитальный период. Длительность пребывания больных обследованной группы в реанимационном отделении составила (в среднем 2,3 ±1,5 суток, а продолжительность всего послеоперационного госпитального этапа в среднем 20±3суток. Необходимость в применении симатомиметиков и (или) адреномиметиков в первые 1-3 суток после операции, в связи с признаками миокардиальной слабости левого желудочка сердца, имела место у 4 пациентов. По данным инструментального исследования отмечалось улучшение показателей внутрисердечной гемодинамики и перфузии миокарда в зонах клеточной интрамиокардиальной трансплантации, не было выявлено заметных отрицательных отклонений от обычного течения, хотя и обращало на себя внимание развитие транзиторных нарушений ритма у 3 (30) % больных в период с 3 по 10 сутки: у одного пациента - пароксизмальное трепетание предсердий, у двух - множественные предсердные или желудочковые экстрасистолы, которые были купированы применением антиаритмических препаратов. Улучшение в самочувствии перед выпиской из стационара отмечали все пациенты. К этому моменту показатели у них клинического и биохимического анализа крови и мочи не отличались от нормальных.

Обследование в отдаленный срок (1-3 года) после трансплантации. Из 10 пациентов живы 9 больных, одна больная умерла через 11 месяцев после операции от острого нарушения мозгового кровообращения (со слов родственников). Улучшение состояния по сравнению с дооперационным периодом отмечали все больные. 2 пациентов относятся к I ФК, 6 пациентов - ко II ФК, 1 пациент - к III ФК по классификации NYHA. Стенокардия напряжения сохраняется у 2 больных, но выражена меньше, чем перед операцией. Динамика показателей клинико-инструментального обследования представлена в таблице 3.

Таблица 3

Динамика показателей клинико-инструментального обследования у больных ПКС - участников пилотного исследования через 12месяцев после

кардиохирургического вмешательства

Период ФК по NYHA Стенокардия

напряжения ЭКГ ЭхоКГ ОФЭКТ

Исходно перед операцией

3,0±0,4

n=7 Коронарная недостаточность n=4, нарушения реполяризации n=4 ФВ 55,2±16,4%

ФУ 29,1±3,5% Снижение перфузии миокарда в среднем на 50,8± 12,8,%;

количество сегментов с гипоперфузией в среднем 7,1±2,2

Через 12 месяцев после операций

2,1±0,5*

улучшение n=9 ФВ 66,5±7,4%*

ФУ 36,1±3,5%*

Снижение перфузии миокарда в среднем 36,8± 11,3 %*;

количество сегментов с гипоперфузией от 3,6±1,8*

Примечание: n-количество больных, ФВ - фракция выброса левого желудочка сердца, ФУ - фракция укорочения, * достоверность различия сравниваемых показателей p<0,05

По данным ЭХоКГ функция искусственных клапанов сердца на момент обследования была у всех пациентов удовлетворительной, не отмечалось признаков тромбоза, инфекционного (протезного) эндокардита или парапротезной фистулы. У всех больных по сравнению с предоперационным периодом уменьшились размеры камер сердца и улучшились показатели внутрисердечной гемодинамики. Улучшение сократительной способности миокарда (возрастание ФВ и ФУ) зарегистрировано у 7 пациентов. Ни в одном случае в местах интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ не отмечено возникновения зон гипо- и акинезий или патологических участков фиброза, кальциноза, оссификации. По данным ОФЭКТ улучшение перфузии миокарда по сравнению с дооперационным периодом отмечено у 7 пациентов, что проявилось в снижении степени и площади нарушения перфузии. В зонах интрамиокардиальной инъекций клеточных трансплантатов улучшение перфузии отмечено у всех больных, а в зонах интракоронарного введения клеток у 2 из 4 пациентов. Выраженная положительная динамика перфузии миокарда наблюдалась после клеточной трансплантации даже в зонах рубцовых (постинфарктных) изменений миокарда (рис.3).

А B C 0% 100%

Рис.3 Динамика перфузионных полярных томосцинтиграмм миокарда левого желудочка у больного А.,55 лет после протезирования аортального клапана и интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ в зону постинфарктного рубца.

Обозначение: А- до операции, B- через 12 месяцев , С - через 36 месяцев после операции. Стрелка указывает на резкий дефект перфузии задней стенки миокарда левого желудочка в зоне постинфарктного рубца. Шкала перфузии от 0 % до 100%

Данные иммунологического исследования показали, что у всех больных к этому сроку отмечалась положительная динамика в показателях иммунограммы: в клеточном звене иммунитета - повышение CD4/CD8 (Т-хелперы /Т-цитотоксические лимфоциты) и снижение CD4/CD8 было менее выражено, чем перед операцией и сохранилось только у 2 из 5 пациентов; возросла функциональная активность лейкоцитов (РТМЛ)- снижение спонтанной миграции гранулоцитов сохранилось у 3 из 8 пациентов, а снижение спонтанной миграции мононуклеаров - у 4 из 9 пациентов, снижение индекса торможения миграции гранулоцитов у 4 из 8 пациентов, снижение индекса торможения миграции мононуклеаров у 3 из 9 пациентов; нормализовалась поглотительная активность нейтрофилов; перестали регистрироваться нарушения в гуморальном звене иммунитета.

Выводы

1. У больных ПКС, до хирургической коррекции, выявлялось нарушение кровоснабжения миокарда преимущественно на уровне мелких сосудов: среди пациентов, имевших клинико-электрокардиографические признаки хронической коронарной недостаточности, лишь в 23% случаев по данным коронарографии отмечался гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий, а по данным ОФЭКТ у всех обследованных пациентов зарегистрирована различной степени гипоперфузия миокарда, которая только у 8 % больных была обусловлена стенозированием проксимального отдела коронарных русла.

2. Клинически микрососудистая ишемия (гипоперфузия) миокарда у половины больных ПКС проявлялась как кардиальный синдром X, в остальных случаях протекала скрытно.