Эхокардиография. ЭхоКГ выполнена на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейного датчика 13 МГц по стандартной методике. При моделировании острого инфаркта миокарда в каждой группе животных ЭхоКГ выполнялась до операции, через 14 суток и 1 год после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда - перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации. Эхокардиография проводилась с параллельной регистрацией ЭКГ-сигнала. В режиме М- сканирования регистрировался конечно - диастолический размер левого желудочка (КДРлж, мм). Систолическую функцию левого желудочка регистрировали с помощью 2D — сканирования из верхушечного доступа в четырехкамерной и двухкамерной позициях. Расчеты фракции выброса (ФВ,%) по модифицированному дисковому методу Simpson проводили, используя встроенные программы эхокамер. Скорость кровоток в аорте (VAo, мм/сек) оценивали в режиме импульсно-волновой доштлерографии. Также изучали динамику состояния стенки левого желудочка сердца в зоне моделирования и лечения инфаркта или постинфарктного кардиосклероза в опытных и контрольных группах - наличие дискинезии, гипокинезии, акинезии, очагов патологической дифференцировки клеток (кальцификации и оссификации) в местах трансплантации.

Методика оценки перфузии миокарда. Оценка перфузии выполнялась методом ОФЭКТ. Использовался РФП Myoview (Nycomed, Великобритания), меченый технецием-99т. РФП в дозе 30-50 МБк вводился в краевую вену уха через периферический катетер. Спустя 10-15 минут после инъекции выполнялась ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере E.Cam. var (Siemens, Германия). Для количественной оценки уровня перфузии миокарда использовали показатель соотношения среднего значения накопления РФП в патологической зоне к таковому в референтной зоне. Оценку равномерности перфузии определяли по соотношению максимального и минимального значений пикселя в патологической и референтной зонах. При моделировании острого инфаркта миокарда во всех группах животных ОФЭКТ выполнялась до операции (норма), через 10 суток, 1, 3, 6, 12 месяцев после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда - перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации.

Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда и измерения дилатации левого желудочка и гистологическое исследование. При моделировании острого инфаркта миокарда во всех группах животных через 12 месяцев после операции, а при моделировании хронической ишемии миокарда через 6 месяцев после трансплантации сразу после эвтаназии животных) извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины (1- верхушечный, 2-срединный, 3- базальный). Затем срезы помещали в 10% раствор формалина на 4 суток. После фиксации каждый сегмент сердца заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 7 мкм по общепринятой методике. Гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по Маллори, позволяющему выявить различные виды соединительной ткани. При этом коллагеновые волокна приобретали окраску разной интенсивности: от голубой до синей. Гистологические препараты сканировали и проводили компьютерную обработку полученных изображений с помощью программы Adobe Photoshop CS2. Общую площадь рубца вычисляли по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза. Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отношение площади просвета левого желудочка к площади миокарда обоих желудочков. Полученный индекс дилатации левого желудочка (в отн. ед.). Гистологическое исследование проводили на микроскопе «Биолам» (Россия).

Количественная оценка васкуляризации зоны поврежденного миокарда. Оценивалась пограничная с рубцом зона. В каждом препарате в пяти последовательных полях зрения при увеличении х400 (окраска по Маллори) производился подсчет среднего количества сосудов регулируемого типа: артериол, капилляров, венул и нерегулируемого типа - синусоидов.

Оценка безопасности применения методов стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде. Для оценки безопасности клеточной трансплантации и введения ФРС в опытных и контрольных группах сравнивались такие показатели, как интра - и послеоперационная летальность, частота развития в раннем послеоперационном периоде аритмий и гнойно-воспалительных осложнений. В отдаленные сроки наблюдения (до 2 лет) по данным вскрытий макроскопически оценивалось состояние сердца и других внутренних органов (на предмет возникновения неопластических процессов), а микроскопически – наличие патологических изменений в миокарде в зоне трансплантации (появление клеток с нетипичной дифференцировкой – очагов склероза, остеогенеза).

0скопом. С помощью окуляр-микрометра определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата. ИП в контрольной группе принимали за 100% и ИП в опытных группах сопоставляли с ним.

Статистическая обработка. Для статистической обработки данных использовалась статистическая программа SPSS. При небольшом числе наблюдений достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Все данные представляли в виде "среднее ± стандартное отклонение" и значение р менее 0,05 рассматривали в качестве значимого.

Результаты собственных исследований.

Результаты клинического исследования синдрома микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС.

По данным клинико-электрокардиографического обследования до хирургической коррекции ПКС у 91 (51%) из 180 пациентов выявлены признаки хронической недостаточности коронарного кровоснабжения. Среди них 57 (62%) больных имели порок аортального, 24 (26%) больных- порок митрального и 13 (12%) больных – порок митрального и аортального клапанов различной этиологии. По данным коронарографии лишь у 25 % из них имелся гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий или их ветвей, не было выявлено патологических изменений коронарных артерий у 56 % пациентов, или стеноз был гемодинамически незначимый - у 21% пациентов.

По данным ОФЭКТ различной степени нарушения перфузии миокарда зарегистрированы у всех (100%) обследованных больных ПКС: 4% пациентов имели участки с незначительной , 43% пациентов - с умеренной, 43% пациентов- с выраженной и 10% пациентов- с резкой гипоперфузией (рис.1).

Рис.1 Состояние перфузии миокарда у обследованных больных ПКС по данным ОФЭКТ

Из них только у 8% пациентов по данным коронарографии выявлялся гемодинамически значимый стеноз коронарных артерий. Количество пораженных сегментов миокарда левого желудочка сердца с гипоперфузией варьировало от 1 до 15 (в среднем 5±2,1), а площадь миокарда со сниженной перфузией на полярных диаграммах составила в среднем 24±7% от общей площади миокарда левого желудочка. Снижение перфузии миокарда имело место у больных с различной этиологией ПКС, но наиболее выраженные нарушения отмечены у пациентов с инфекционным эндокардитом и хронической ревматической болезнью сердца. Среди больных, имевших хроническую микрососудистую ишемию миокарда, лишь у половины пациентов отмечались типичные для ИБС клинико-электрокардиографические изменения, у остальных пациентов процесс протекал скрытно. Признаки ремоделирования миокарда (гипертрофия, кардиосклероз) зарегистрированы у 96% больных, его дисфункция (диастолическая и систолическая) имелась у 71% пациентов. По данным обследования у больных ПКС были выявлены отдельные признаки метаболического синдрома: артериальная гипертензия – у 62% пациентов, ожирение - у 19% пациентов, сахарный диабет 2 типа - у 7% пациентов, дислипидемия - у 21% пациентов. В показателях иммунограммы у обследованных больных ПКС отмечались различные отклонения от нормы: чаще всего отмечалось снижение активности лейкоцитов (снижение миграции, незавершенность фагоцитоза).

При сравнении особенностей течения интраоперационного и послеоперационного (госпитального) периода у больных с исходной незначительной и умеренной гипоперфузией миокарда и у пациентов с выраженной и резкой гипоперфузией было отмечено более тяжелое течение во втором случае: в 1,7 раза чаще для восстановления сердечной деятельности во время операции использовалась дефибрилляция, в 2,2 раза чаще отмечалась сердечная слабость, требующая медикаментозной поддержки, в 2,8 раза чаще развивались нарушения сердечного ритма, в 1,3 раза дольше были сроки пребывания в реанимационном отделении и сроки госпитального послеоперационного периода в целом, только в этой группе наблюдалась ранняя послеоперационная летальность.

По данным клинико- инструментального обследования 52 больных, выполненного через 12 месяцев после стандартной хирургической коррекции ПКС у всех пациентов функция ИКС была удовлетворительная. К этому моменту улучшение в самочувствии отметили 42 (81 %) пациентов, отсутствие положительной динамики было у 10 (19 %) пациентов. Стенокардия напряжения сохранялась у 5 (11 %) больных, отмечена положительная динамика функционального класса (по NYHA) у 40 (77%) пациентов. Исследование перфузии миокарда методом ОФЭКТ показало, что улучшение по сравнению с дооперационным периодом произошло у 34 (65 %) больных, без динамики – у 14 (27 %) больных, ухудшение - у 4 (8 %) больных. Количество сегментов с гипоперфузией сократилось в среднем с 5±2,1 до 3±1,5 , а площадь миокарда с гипоперфузией по отношению ко всей площади миокарда левого желудочка (по полярным перфузионным диаграммам) снизилась с 24 ± 7% до 15± 8%. Среди 32 пациентов, исходно имевших незначительное или умеренное снижение перфузии миокарда, улучшение ее произошло у всех (100 %) больных. Вместе с тем только у 3 (6 %) пациентов наблюдалось полное восстановление перфузии до уровня здорового миокарда. Среди 20 пациентов с исходным выраженным и резким снижением перфузии (более чем 50% от максимальной) улучшение перфузии после операции наблюдалось лишь у 2 (10 %) пациентов, а в 70 % случаев было без динамики (18 пациентов) или даже ухудшилось- 4 (20 %) пациента. Это были больные пожилого возраста (средний возраст 67±7 лет) с распространенным кардиосклерозом (в том числе у 4 больных - постинфарктным), которые перед операцией относились к III или IY ФК по NYHA. Выявлена корреляция между динамикой перфузии миокарда, показателями насосной функции левого желудочка сердца и самочувствием больных: у лиц с положительной динамикой коэффициент корреляции (r) между этими показателями составил соответственно 0,92 и 0,86. Среди 18 пациентов с отсутствием положительной динамики перфузии миокарда во всех случаях сохранялась сниженная фракция выброса левого желудочка сердца, причем у 10 (50 %) больных этот показатель после операции не улучшился и они же субъективно не отмечали заметного улучшения в самочувствии после операции.

Результаты экспериментального раздела исследований.

Оценка ангиогенного эффекта и оптимальной дозы препарата, содержащего ФРС. На модели ишемии нижней конечности крысы по данным гистохимического исследования в группах животных, получивших препарат в дозе 4600 мкг/кг веса животного и 460 мкг/ кг плотность капиллярного русла в зоне ишемии не различалась, но, по сравнении с контрольной группой и группами, получавшими препарат в дозе 4,6 мкг/кг и 46 мкг/кг этот показатель был выше в 5 раз. Таким образом, был зарегистрирован ангиогенный эффект применения препарата, содержащего ФРС и определена оптимальная терапевтическая доза - 460 мкг/ кг веса животного.

Характеристика клеток костного мозга. В результате фракционирования эксфузата костного мозга на градиенте Перколла были выделены МФКАКМ в количестве 2±0,2 x106. В ходе культивирования было показано, что начиная с 3-4 суток появлялись единичные адгезивные клетки, имеющие вытянутую форму. К 12-14 суткам адгезивные клетки формировали монослой, покрывая всё дно культуральной чашки. Морфологически культура становилась гомогенной и, в основном, была представлена вытянутыми фибробластоподобными клетками. После пересева клетки вновь культивировали до образования монослоя. На 2 пассаже мезенхимальные стромальные клетки костного мозга в основном имели веретеновидную форму. После ферментативной обработки и перевода клеток в суспензионное состояние их размер составлял в среднем 15-20 мкм. Общее количество клеток, полученное в результате культивирования, составляло 2±0,2 x106. В ходе культивирования на каждом пассаже делался отсев для проведения цитохимических реакций (на ЩФ для выявление клеток остеогенного ряда и на нейтральные липиды для выявления клеток адипоцитарного ряда). В качестве контроля использовали культуры МСК, дифференцированные в остеогенном и адипоцитарном направлениях. Для индукции дифференцировки в остеогенном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением Р-глицерофосфата натрия (10 мМ; Sigma, США), дексаметазона (100 нМ; Sigma, США) и аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл); для индукции дифференцировки в адипоцитарном направлении использовали среду а-МЕМ с добавлением дексаметазона (10 нМ), аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и ITS + LA-BSA (инсулин, трансферрин, селеновая кислота, линейная алкилбензосульфоновая кислота). Результаты цитохимических реакций показали, что культура клеток, которая применялась для трансплантации, характеризовалась отсутствием спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки. В то же время, проведенные исследования по стимуляции дифференцировки культуры клеток в остеогенном и адипоцитарном направлениях под действием индукторов указывали на их мультипотентность, т.е. культивированные клетки имели характеристику ММСКАКМ.

Детекция трансплантированных клеток в поврежденном миокарде

При моделировании острой ишемии миокарда через 20 суток в зоне интрамиокардиальной трансплантации как МФКАКМ так и культивированных ММСКАКМ выявлялись меченые флуоресцентным красителем клетки соответственно 13±2 % и 9±3% от исходного количества. При моделировании хронической ишемии миокарда через 20 суток в зоне интрамиокардиальной трансплантации МФКАКМ также выявлялись меченые флуоресцентным красителем клетки 68±5% от исходного числа . При трансплантации клеток в периферический венозный кровоток в миокарде они не обнаруживались.

Динамика перфузии миокарда в исследуемых группах. Сводные данные уровня перфузии в зоне поврежденного миокарда представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

Динамика показателей уровня накопления РФП в патологической зоне миокарда при моделировании и лечении острого инфаркта миокарда в исследуемых группах по данным перфузионной ОФЭКТ (M±m, отн. ед.)

Группы Уровень накопления РФП в патологической зоне, сроки исследования

исходно через 10 суток после оперпации через 1,5 месяца после оперпации через 6 месяцев после оперпации Через год после операции

контроль 1,01±

0,01 0,57±

0,02 0,59±

0,04 0,61±

0,02 0,61±

плацебо интрамиокардиально 1,01±

0,02 0,59±

0,02 0,62±

0,02 0,64±

0,04 0,61±

плацебо внутривенно 0,99±

0,02 0,62±

0,02 0,59±

0,02 0,58±

0,04 0,63±