Положения, выносимые на защиту.

1. Для больных пороками клапанов сердца характерно наличие хронической гипоперфузии (ишемии) миокарда, обусловленной не столько поражением магистральных коронарных артерий, сколько изменением микрососудистого кровотока, которая клинически может проявляется как кардиальный синдром Х, так и протекать скрытно.

2. Выраженная микрососудистая ишемии миокарда оказывает неблагоприятное влияние на течение интраоперационного и послеоперационного периода, отдаленные результаты у больных пороками клапанов сердца которым выполнено оперативное лечение порока; стандартные методы хирургической коррекции не восстанавливают перфузию в участках миокарда с исходной выраженной и резкой степенью ее нарушения.

3. В эксперименте, как в условиях острого ишемического повреждения микрососудистого русла (при моделировании инфаркта миокарда), так и в условиях хронической ишемии (при моделировании постинфарктного кардиосклероза) различные способы лечебного ангиогенеза: интрамиокардиальное введение факторов роста сосудов, трансплантация мононуклеарной фракции клеток и культивированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток аутологичного костного мозга улучшают перфузию поврежденного миокарда, способствуют увеличению плотности капилляров в зоне ишемии, но сопровождаются различным репаративным воздействием на поврежденный миокард.

4. У экспериментальных животных, перенесших интрамиокардиальную трансплантацию исследуемых клеток костного мозга, не выявлено, как интраоперационно, так и в ближайшие и отдаленные сроки наблюдения, специфических осложнений.

5. Цитомедины, выделенные из сердечной ткани, оказывают выраженное стимулипрующее действие на развитие органотипической культуры миокарда.

6. Дополнение стандартного хирургического лечения ПКС интракардиальной трансплантацией аутологичной мононуклеарной фракции клеток костного мозга в зоны гипоперфузии миокарда улучшает его кровоснабжение и в сроки наблюдения до 3 лет не сопровождается видимыми побочными отрицательными эффектами.

Степень личного вклада автора в результаты исследования. Автор непосредственно участвовал в обследовании и лечении всех больных, в проведении всех экспериментальных исследований. Самостоятельно проводил сбор, обработку и анализ полученного научного клинического и экспериментального материала, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации.

Исследование выполнено в рамках реализации Приказа Министра здравоохранения РФ №78 от 16.02.2004 г. и решения Ученого Совета СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (протокол №7 от 29.03.2004 г.) об организации Северо-Западного отделения Научно-методического центра клеточной терапии Минздрава России и его взаимодействия с подразделениями Университета для исследования и реализации потенциальных возможностей методов клеточной терапии в интересах клинической медицины.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на III международном конгрессе патофизиологов (Лахти, Финляндия, 1998), на научной конференции «Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии», посвященной 95-летию со дня рождения академика РАМН Ф.Г.Углова (Санкт-Петербург, 1999) на юбилейной научно-практической конференции посвященной 100-летию кафедры госпитальной хирургии №2 СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2001), на международном симпозиуме «Стволовые клетки. Регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 132-м заседании секции сердечно-сосудистой хирургии и ангиологии хирургического общества Н.И. Пирогова (Санкт-Петербург, 2004), на семинаре руководителей врачей-интернов и руководителей производственной практики студентов (Санкт-Петербург, 2005), на 9-й ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН (Москва, 2005), на региональной конференции «Достижения и трудности современной кардиологии», посвященной памяти профессора В.П.Померанцева (Москва, 2005), на 7-м международном симпозиуме всемирной организации искусственных органов, иммунологии и трансплантации (Санкт-Петербург, 2005), на 11-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2005), на юбилейной конференции, посвященной 60-летию кафедры рентгенологии и радиологии СПбГМУ им.акад. И.П.Павлова (Санкт-Петербург, 2005), на III-м всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), на всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006), на научной конференции с международным участием «Новые технологии в ядерной медицине» (Санкт-Петербург, 2006), на 12-м всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2006), на российско-британском совещании в сотрудничестве с Европейской комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, 2007), на всероссийском радиологическом форуме «Невский радиологический форум» (Санкт-Петербург, 2007), на III-м всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), на 157-м заседании секции сердечно-сосудистой хирургии и ангиологии хирургического общества Н.И. Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), на всероссийской научно-практической конференции с международным участием « Высокотехнологичные методы диагностики и лечения сердечно- сосудистых и эндокринных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2007), на научно-практической конференции « Итоги и перспективы творческого сотрудничества кафедры и клиники госпитальной хирурги №2 СПбГМУ и регионов Север-Запада РФ по оказанию кардиохирургической помощи населению» (Санкт-Петербург, 2007), на 13-м Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2007).

Основные результаты диссертации представлены в 30 публикациях, из них 15 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Реализация работы. Полученные в процессе выполнения работы результаты используются в повседневной деятельности кардиохирургического центра кафедры госпитальной хирургии №2, кафедры рентгенологии и радиологии, кафедры патологической физиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова, Северо-Западного филиала научно-методического центра клеточной терапии МЗ РФ (Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д. 6/8). Созданная модель острой и хронической ишемии миокарда и методика оценки перфузии миокарда у кроликов применяются в работе научно-исследовательского центра Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова и Центрального научно-исследовательского института рентгенологии и радиологии МЗ РФ (Санкт-Петербург, Песочный-2, ул.Ленинградская, д.70/4) ; технология выделения и культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга кролика используется в работе отделения клеточных культур института цитологии РАН (Санкт-Петербург, пр. Тихорецкий, д.4). На основании полученных в диссертации данных получен патент на изобретение РФ № 2311140 «Способ лечения больных пороками клапанов сердца».

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя использованной литературы, содержащего 415 источников, в том числе 131- отечественных и 284- зарубежных авторов, приложения. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 71 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Исследование состояло из трёх самостоятельных, последовательно выполненных, взаимообусловленных частей: «определения клинической значимости синдрома микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС», «экспериментального обоснования возможности и безопасности коррекции острой и хронической ишемии миокарда стимуляцией неоангиогенеза путем интракардиальной трансплантации клеток аутологичного костного мозга и ангиогенных факторов роста», «пилотного исследования возможности и безопасности коррекции микрососудистой ишемии миокарда у больных ПКС интракардиальной трансплантацией мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга». Первая и третья часть исследования составили клинический раздел, вторая - экспериментальный раздел работы.

Клинический раздел работы

Для определения клинической значимости микрососудистой ишемии миокарда проведено исследование и оценка состояния кровоснабжения миокарда у 180 больных ПКС, отобранных методом случайной выборки из числа пациентов, проходивших лечение в кардиохирургическом отделении клиники госпитальной хирургии №2 в 2003-2006 годах. Среди них было 89 мужчин и 91 женщина. Возраст обследованных больных составил от 20 до 76 лет (средний возраст 47 ± 7,4 года). В соответствии с критериями классификации хронической сердечной недостаточности Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA), 26 (14%) больных относились ко второму функциональному классу (II ФК), 148 (82%) больных – к третьему функциональному классу (III ФК), 6 (4%) больных – к третьему-четвертому функциональному классу (III- IY ФК). У 76 (42%) пациентов был порок аортального клапана, у 80 (44%) пациентов - митрального и у 24 ( 14%) пациентов- митрального и аортального клапанов. Этиологии ПКС у больных была следующая : хроническая ревматическая болезнь сердца - 111(62%) пациентов, атеросклероз- 23 (13%) пациента, инфекционный эндокардит -26 (14%) пациентов. врожденный порок- стеноз бикуспидального аортального клапана- 16 (9%) пациентов и пролапс митрального клапана – 4 (2%) пациента.

Анализ состояния кровоснабжения миокарда проводили на основании комплексного клинико-инструментального исследования. При сборе анамнеза, жалоб и физикального обследования выясняли наличие перенесенного инфаркта миокарда и стенокардии напряжения, выраженность которой оценивали в соответствии с классификацией CCS (Canadian Cardiovascular Society), определяли ФК сердечной недостаточности по NYHA, наличие дополнительных факторов, повышающих риск развития микрососудистой ишемии миокарда: артериальной гипертензии и ожирения, гипергликемии, дислипидемии (на основании данных биохимического исследования крови).

ЭКГ регистрировалась в стандартных и грудных отведениях с помощью электрокардиографа Fukuda 3010 (Япония) в состоянии функционального покоя пациента. Признаками хронической гипоксии миокарда считали наличие отрицательного симметричного, заостренного или двухфазного зубца Т и горизонтальное смещение сегмента ST (депрессия или подъем) на 1 мм и более от изоэлектрической линии. Также выясняли наличие признаков ремоделирования миокарда: гипертрофии левого и правого желудочков, рубцовых изменений в нем, определяли локализацию и характер кардиосклероза.

ЭхоКГ выполнена по стандартной методике с синхронной регистрацией ЭКГ на эхокамере Sequoia 512 (Acuson, США) с использованием линейных датчиков 2 и 5 МГц в состоянии функционального покоя пациента. Среди исследуемых параметров особое внимание уделялось выявлению признаков гипертрофии желудочков сердца (утолщение их стенок) и локальных зон нарушения сократимости (гипо- и акинезии) миокарда . Оценивали сократительную способность миокарда левого желудочка сердца, рассчитывая фракцию выброса (ФВ) (норма- более 55%) по методу Simpson и фракцию укорочения (ФУ) (норма - более 25%), а также стандартные показатели, характеризующие его дивастолическую функцию используя встроенные программы эхокардиографа.

Больным, у которых указанными методами выявлялась хроническая недостаточность коронарного кровоснабжения дополнительно по стандартной методке выполняли селективную коронарографию (КГ) на ангиографе Multistar D (Siemens, Германия). При оценке ангиограмм использовали классификацию Ю.С.Петросяна и Л.С. Зингермана (1974): определяли анатомический тип кровоснабжения сердца (левый, правый, сбалансированный), локализацию поражения коронарных артерий, степень сужения артерии (без сужения просвета, гемодинамически незначимый стеноз – сужение просвета менее 50%, гемодинамически значимый стеноз - сужение просвета более 50%, окклюзия), наличие коллатеральных перетоков и спазмов.

Исследование перфузии миокарда в состоянии функционального покоя пациента выполнено у 36 больных, имевших клинические и ЭКГ проявления ишемии миокарда и у 36 больных без них, методом ОФЭКТ на томографической двухдетекторной гамма - камере DDC-61 Piccer (США) и Philips Forte 2005 (США) с применением параллельных коллиматоров высокого разрешения по стандартной методике с использованием радиофармацевтического препарата (РФП) 99m Тс-технетрил (Диамед, Россия) в дозе 1000 МБк, который вводился в локтевую вену. Первичный массив информации обрабатывался сопряженной с гамма-камерой рабочей станцией Philips Jet Stream (на платформе IBM/ Windows XP) с применением специального программного обеспечения Philips AutoSPECT. В результате такой обработки и реконструкции получали серию срезов миокарда в поперечной, фронтальной и саггитальной плоскостях. Полученные таким образом срезы оценивались визуально и обрабатывались количественно с применением пакета Philips ADAC AutoQuant 6.0. Основой количественной оценки являлось ориентированное в одной плоскости изображение миокарда левого желудочка (bull eye). Полученные изображения (полярные перфузионные диаграммы) разделялись на 20 сегментов, позволяющих точно локализовать участки нарушения перфузии не только по отношению к стенкам левого желудочка (передней, задней, латеральной, межжелудочковой перегородке), но и в соответствии со схемой бассейнов коронарных артерий. Участки ишемии миокарда визуализируются в виде снижения накопления РФП «дефектов перфузии» по отношению к интактному миокарду. Различали следующие степени нарушения перфузии миокарда: «незначительное снижение» (снижение накопления РФП менее 30% от максимального), «умеренное снижение» (от 30% до 50%), «выраженное снижение» (от 50% до 70%), «резкое снижение» (свыше 70 %), соответствующее рубцовым изменениям.

У 60 больных ПКС проведено динамическое исследование изменений перфузии миокарда через 1 и 12 месяцев после стандартной хирургической коррекции ПКС (протезирования аортального клапана – у 23 больных, митрального клапана – у 23 больных, митрального и аортального клапанов - у 10 больных и у 4 больных в сочетании с аортокоронарным шунтированием) и изучена ее взаимосвязь с динамикой самочувствия, состояния пациентов и показателями насосной функции левого желудочка сердца. Также у этих больных проведен сравнительный анализ течения послеоперационного (госпитального) периода в зависимости от исходного состояния перфузии миокарда: с незначительной и умеренной гипоперфузией и с выраженной и резкой гипоперфузией.

В пилотном исследовании у 10 больных ПКС, на основе их добровольного информированного согласия, изучались возможность и безопасность коррекции микрососудистой ишемии миокарда методом интракардиальной трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга (МФКАКМ), выполненной в комплексе со стандартным хирургическом лечением. Критерием включения в эту группу (показанием для клеточной трансплантации) было выявление у пациентов в миокарде рубцовых изменений и зон выраженной и резкой гипоперфузии, которые не были связаны со стенозом проксимального отдела коронарных артерий и поэтому стандартные методы реваскуляризации в этих случаях были бы непригодны. Среди них было 7 мужчин и 3 женщины, в возрасте от 36 до 62 лет (средний возраст 50±12 года). У 9 пациентов было поражение одного клапана (митрального – у 4 больных, аортального - у 5 больных), у 1 пациента- поражение двух клапанов- аортального и митрального. Этиология ПКС была следующей: хроническая ревматическая болезнь сердца - 5 пациентов, атеросклероз- 2 пациента, инфекционный эндокардит - 2 пациента, врожденный бикуспидальный аортальный клапан со стенозом – 1 пациент. Среди пациентов этой группы 7 больных предъявляли жалобы на загрудинные боли при физической нагрузке, соответствующие стабильной стенокардии напряжения II-III ФК по CCS, 9 больных - на одышку при умеренной или незначительной физической нагрузке. 8 пациентов относились к III ФК, а 2 пациентов - к IY ФК сердечной недостаточности по NYHA. У больных этой группы перед хирургической коррекцией ПКС кроме указанных выше исследований выполнена стандартная иммунограмма.

Для оценки пригодности костного мозга грудины для клеточной трансплантации у 20 пациентов (10 пациентов - участников пилотного исследования и 10 пациентов из основной группы) в возрасте от 32 до 76 лет выполнена стернальная пункция с последующей оценкой функционального состояния костного мозга методом культивирования на наличие гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Клетки трансплантата культивировали в течение 14 дней в питательной среде на основе метилцелюлозы с добавлением ростовых факторов - Metho-Cult Methylcellulose Medium For Colony Assays of Human cells (WAK-CHEMIE Medical GMBH) в условиях 100% влажности и содержания СО2 от 5 % до 10%, без пересева. О наличии в культуре ГСК судили общепринятым способом - подсчитывали среднее количество колониеобразующих единиц гранулоцитарно-моноцитарного ряда (КОЕ-ГМ) и бурстообразующих единиц эритроидного ряда (БОЕ-Э) на 4 чашках Петри. ММСК культивировали в пластиковой посуде в течение 21 дня в среде ? - МЕМ (ISN, США) с 10 % сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл) в СО2- инкубаторе при 5% концентрации углекислого газа. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту 50 мкг/мл). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА (Gibco, США). Критериями наличия колоний МСК считали адгезивность клеток к пластику; появление из этих колоний при длительном культивировании спонтанно дифференцированных в различных направлениях клеток. Сравнивались результаты культивирования в двух возрастных группах больных: до 50 лет (10 пациентов) и от 50 лет и старше (10 пациентов)

Всем пациентам – участникам пилотного исследования интраоперационно, перед стернотомией, пункционно выполнена миелоэксфузия (у 1 из подвздошной кости, у 9 пациентов - из грудины) в объеме 120± 5 мл. Затем выделяли МФКАКМ методом седиментации, используя 6% гидроксиэтилированного крахмала (6% HAES, Фрезениус) в соотношении 1:4 (к смеси костного мозга с гепарином) (Шавва С.А., 1994).Общий объем трансплантата МФКАКМ был 20±5 мл и содержал 0,7*109 до 1,3*109 (в среднем 1,0±0,3 *109) клеток. Подсчет клеток в трансплантате проводили в камере Горяева, а жизнеспособность определяли по проценту окрашенных 0,4% раствором трипанового синего (Лабтех, Россия) клеток. После того, как был закончен основной этап хирургической коррекции: протезирование митрального клапана у 4 пациентов, аортального клапана у - 5 пациентов и митрального и аортального клапанов – у 1 пациента и дополнительно у 4 пациентов - аортокоронарное шунтирование и герметизированы камеры сердца, в зоны гипоперфузии путем множественных интрамиокардиальных инъекций от 10 до 20 ( в среднем 18±2), каждая объемом не более 0.2 мл, производилась трансплантация МФКАКМ, оставшийся объем клеток вводился или в шунты или интракоронарно. У этих больных комплексное клинико-инструментальное обследование выполнялось в динамике через 1 , 12 месяцев, а у некоторых и через 36 месяцев после клеточной трансплантации.

Экспериментальный раздел работы

Опыты проведены на 65 крысах-самцах массой 230±15 г. и на 118 кроликах-самцах линии Шиншиллы массой 2,7-3.0 кг.

Выполнено сравнительное исследование возможности стимуляции неоангиогенеза в зоне острого и хронического повреждения (ишемии) сосудистой сети миокарда кролика на основе интрамиокардиального (или внутривенного - в периферическую вену) введения препарата, содержащего смесь факторов роста сосудов (ФРС), МФКАКМ и культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутолгичного костного мозга (ММСКАКМ) кролика.

Получение и исследование ангиогенной активности препарата, содержащего ФРС. В исследовании применялся экспериментальный препарат, содержащий смесь естественных человеческих факторов роста сосудов, аналогичный препарату «Endothelial cell growth supplement» (Sigma,США). Препарат изготовлялся в НИИ цитологии РАН по методике T. Maciag et al. (1979), модифицированной В.М. Седовым и соавторами (патент на изобретение РФ № 2214256 от 20.10. 2003 года) из мозговой ткани 17-23 недельных плодов человека, полученных малым кесаревым сечением в центре репродукции г. Санкт-Петербурга, выполненной по социальным и медицинским показаниям и использованных в научных целях с разрешения комитета здравоохранения г.Санкт-Петербурга. Для подтверждения ангиогенного эффекта и определения оптимальной терапевтической дозы препарат вводился инъекционно из 6 точек в мышцы интрамускулярно в концентрации 4600 мкг/кг; 460 мкг/кг; 46 мкг/кг; 4-4,6 мкг/кг в ишемизированные мышцы голени на 10 сутки после перевязки моделирование ишемии нижней конечности , которая осуществлялась перевязкой и пересечением бедренной артерии и её ветвей на левой задней лапе под нембуталовой анестезией в дозе 60 мг/кг веса животного (Yang H.T.et al., 1996) и сравнивался с контрольной группой, где аналогично вводился равный объем физиологического раствора . Количество капилляров в зоне ишемии определяли гистохимическим исследованием с постановкой реакции на выявление активности щелочной фосфатазы, позволяющей визуализировать функционирующие капилляры, число которых подсчитывалось по стандартной методике в 10 произвольно выбранных полях зрения с последующим усреднением данных на продольных и поперечных срезах.

Получение, характеристика и окрашивание клеток костного мозга.

Аспират костного мозга в объеме 10±1 мл получали у кролика путем пункции крыла подвздошной кости после премедикации (дролеридол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг) под местной анестезией 0,5% раствором новокаина и помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS (citrate phosphate dextrose solution; Terumo, Япония). МФКАКМ фракционировали с помощью центрифугирования (1600 g, 20 мин) в градиенте плотности Перколла (63%). Образовавшееся интерфазное кольцо с ядросодержащими клетками промывали в растворе Хенкса без Са2+ и Mg~+(Gibco, США) и осаждали центрифугированием. Культуру ММСКАКМ получали путем культивирования МФКАКМ. Культивирование МФКАКМ проводили в среде а-МЕМ (ICN, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и гентамицина сульфата (50 мкг/мл; Invitrogen, Великобритания) в СО2-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа в течение 3 недель. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл; ICN, США). Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи 0,25% раствора трипсина (Gibco, США) и ЭДТА (0,02% этилендиаминтетрауксусная кислота, Gibco, США).

Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат с нитросиним тетразолем, Sigma, США) на щелочную фосфатазу (ЩФ) для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и смесью суданов III и IV (BDH, Великобритания) для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

Перед трансплантацией клетки костного мозга окрашивали ядерным флуоресцентным красителем Hoechst (Sigma, США). Для этого перед трансплантацией в клеточную суспензию добавляли флуорохром в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут в СО2-инкубаторе на шейкере. Из суспензии клеток готовили препараты и изучали на флуоресцентном микроскопе. При этом ядра клеток светились ярко-голубым цветом.

Подсчет клеток в суспензии и определение их жизнеспособности. Подсчет клеток костного мозга проводили в камере Горяева, а жизнеспособность определяли с помощью окраски трипановым синим (Лабтех, Россия).

Моделирование острого ишемического повреждения сосудистой сети миокарда (инфаркт миокарда), характеристика исследованных групп. Инфаркт миокарда воспроизводился лигированием левой коронарной артерии (Landau C. et al., 1995) у 118 кроликов. В условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом выполняли левостороннюю торакотомию в четвертом межреберье и перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца. Через 10 минут после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально инъекционно с помощью инсулинового шприца из 6 точек вводили препарат, содержащий ФРС в дозе 500 мк/кг или клетки в среднем 2±0,2 x106 (МФКАКМ и культуру ММСКАКМ) в 0,4 мл ростовой среды а-МЕМ (модифицированная среда Игла) или эквивалентное количество питательной среды (плацебо) либо аналогичное количество клеток и плацебо вводились через 10 минут после коронароокклюзии в краевую вену уха кролика через катетер. В контрольной группе животных инъекций в миокард не производилось. Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. В каждой группе было по 13 животных.

Моделирование хронической ишемии миокарда (постинфарктный миокарда), характеристика исследованных групп. 30 кроликов через год после моделирования инфаркта миокарда и не получавших никакого лечения, когда у них сформировался постинфарктный кардиосклероз и хроническая ишемия были повторно оперированы. Им в аналогичных, описанным выше условиях обезболивания и искусственной вентиляции легких, была повторно выполнена торакотомия с иссечением послеоперационного рубца, затем 10 животным (опытная группа) в зону постинфарктного рубца и вокруг него из 6 точек вводились МФКАКМ, полученная в день операции в количестве 2±0,3 х106 , другим 10 животным (группа, получавшая плацебо) - вводилось эквивалентное количество питательной среды а-МЕМ, а в контрольной группе лечения не проводилось.

Идентификация меченых трансплантированных клеток в миокарде. Через 20 суток после трансплантации клеток трех кроликов из каждой группы выводили из эксперимента (такой срок определялся длительностью жизни флуорохрома). Сердце разрезали на 2 части (базальную и апикальную) таким образом, что плоскость разреза проходила на уровне лигатуры перпендикулярно длинной оси сердца. Апикальную часть сердца измельчали и подвергали ферментативной диссоциации смесью трипсин-коллагеназы (Siigma, США). Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием, наносили на предметное стекло и производили подсчет меченых клеток. Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioscop» (Zeiss, Германия).

Электрокардиография. При моделировании острого инфаркта миокарда во всех группах животных ЭКГ выполнялась до операции (норма), через 3 суток, 7 суток, 30 суток после операции и перед выведением животного из эксперимента (1 год после операции), а при моделировании хронической ишемии миокарда - перед повторной операцией и через 6 месяцев после трансплантации. Использовали портативный одноканальный электрокардиограф ЭКГ-001 («Красногвардеец», Россия). Амплитуда устанавливалась на 20 мм, а скорость лентопротяжного механизма - на 50 мм/с. Оценку ЭКГ проводили по второму стандартному отведению